伤科敷液涂剂的皮肤毒性和安全性研究

孔庆民，张琰

济宁市兖州区中医院，山东兖州　272100

伤科敷液涂剂的皮肤毒性和安全性研究

孔庆民，张琰

济宁市兖州区中医院，山东兖州272100

目的研究伤科敷液涂剂经皮肤用药的皮肤毒性和安全性。方法2014年5月—2015年3月期间选择清洁级家兔（白色长毛）、豚鼠（DHP）作为实验动物，用家兔急性皮肤毒性试验、豚鼠皮肤过敏性试验、家兔皮肤刺激性试验，研究伤科敷液涂剂经皮肤用药的急性毒性、过敏性、刺激性。结果伤科敷液涂剂对家兔急性皮肤毒性试验，在皮肤完整和破损两种状态下，均未见皮肤毒性反应；伤科敷液涂剂对豚鼠皮肤过敏性试验，未见过敏反应；家兔完整皮肤试验无刺激性，破损皮肤试验高剂量组、中剂量组损伤皮肤刺激指数达到0.6、0.3，用药后48～72 h缓解痊愈为0.3和0，其他组刺激指数均为0，涂药区与空白对照区差异无统计学意义（P＞0.05）。结论伤科敷液涂剂经皮肤给药无明显皮肤毒性，安全性良好。

伤科敷液涂剂；急性皮肤毒性；皮肤过敏性；皮肤刺激性

伤科敷液涂剂主要由黄连、栀子、黄柏、紫草、苦参、虎杖、大黄、明矾等精制而成，功能清热活血、祛瘀止痛，皮肤用药治疗骨折挫伤等。由于伤科敷液涂剂属于成分复杂的中药复方制剂，有机化学成分较多，因而其安全性和皮肤毒性难以预估。为此，该次研究基于国家食品药品监督管理总局《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，2014年5月—2015年3月期间选择清洁级家兔（白色长毛）、豚鼠（DHP）作为实验动物，其中家兔共80只，豚鼠共20只，展开了伤科敷液涂剂的临床应用安全性研究，对比分析了伤科敷液涂剂进行了经皮给药的皮肤毒性和安全性研究，旨在为伤科敷液涂剂临床用药提供一些具体指导，保证该药外用安全性。

1　临床资料

1.1试验动物

2014年5月—2015年3月期间选择清洁级家兔（白色长毛）、豚鼠（DHP）作为实验动物，济宁市兖州区中医院开展动物实验研究。其中家兔共80只（雌雄各半），豚鼠共20（雌雄各半），两种动物在实验中心常规喂养，各家兔饲料无差异，各豚鼠饲料无差异。家兔体重1.7～2.5 kg，平均体重（2.12±0.41）kg；DHP豚鼠，体重190～300 g，平均体重（243.16±55.62）g；实验动物饲养较为稳定，已排除患病动物、皮肤破损或品种不同的实验动物。

1.2实验药品

伤科敷液涂剂由济宁市皮肤病防治院制剂室制备；空白对照药为生理盐水；阳性对照药品为2，4-二硝基氯代苯（DNCB），硫化钠均为化学试剂标准品，使用前药品均未开启包装，按说明书要求存储，未过期或受污染。

2　方法与结果

2.1急性皮肤毒性试验

2.1.1试验方法取清洁级家兔40只，按随机数字分类法均分为4组（n=10），包括空白对照组和伤科敷液涂剂高、中、低浓度组。高、中、低浓度组依照伤科敷液涂剂的临床浓度，依次浓缩至9倍浓度、3倍浓度和正常浓度［1-2］。实验动物右侧背部剃毛留出7 cm左右的正方形，面积约为50 cm2，常规消毒后，分别涂抹受测浓度药物，停留24 h后生理盐水洗净［3］。采用24 h不间断摄像观察受试动物行为、心率、眼腈、粘膜、体重、皮毛、饮食、二便、行为是否有改变及自主活动改变，1次/d，连续观察期14 d。完整皮肤检测无毒性反应的动物，对侧皮肤同样做剃毛处理，静置24 h消毒后，用细砂纸建立皮肤损伤模型，然后涂擦受试药物，再次观察上述行为、心率、眼腈、粘膜、体重、皮毛、饮食、二便、行为指标［4］。试验过程中，随时注意动物异常举动，若出现死亡前兆应记录尸检，观察体内病变情况，急性死亡动物也立即进行尸检。

2.1.2试验结果受试家兔完整皮肤用药后，各组家兔生命体征、生理活动、行为及自主活动情况均无显著改变，无死亡或致病者。受试家兔破损皮肤用药后，各组家兔生命体征、生理活动、行为及自主活动情况均无显著改变，无死亡或致病者。破损皮肤伤科敷液涂剂高、中、低剂量各给药组给药后24 h，皮损局部已经出现明显血痂，无明显红肿和感染症状，约在4～7 d后，血痂完全脱落，愈合良好。在观察期内，各给药组与空白对照组体重比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1　中国家兔的体重变化±s）

表1　中国家兔的体重变化±s）

组别给药前完整皮肤动物破损皮肤动物高剂量（n=10）中剂量（n=10）低剂量（n=10）空白对照（n=10）2.14±0.16 2.15±0.17 2.14±0.16 2.15±0.17 2.26±0.18 2.27±0.19 2.26±0.18 2.26±0.18 2.41±0.23 2.41±0.24 2.42±0.25 2.42±0.25

2.2皮肤过敏性试验

2.2.1试验方法取DHP豚鼠20只，雌雄各半，随机分为2组（n=10），伤科敷液涂剂组和阳性对照组［2，4-二硝基氯代苯］［5-6］。①致敏接触：对实验动物的两侧皮肤进行剃毛，剃出5 cm×2 cm的面积，然后静置不干预保持24 h，然后先在豚鼠背部的左脱毛区伤科敷液涂剂组涂以0.2 mL伤科敷液涂剂、阳性对照组涂以1%DNCB（采用丙酮作为有机溶剂，激发溶液0.1%）0.2 mL，接触6 h后洗除受试物，初次致敏试验后第7天再分别用同法对实验动物剃毛区域进行再次涂抹药物，洗除方法同对照组，第14天实验同第7天。②激发接触：3次致敏试验后，间隔14 d后，实验动物右侧测试区涂伤科敷液涂剂0.2 mL，阳性对照组涂0.1%DNCB 0.2 mL，于接触6 h后用温水洗除受试物，开始激发解除实验。分别于0、24、48、72 h，对皮肤稳定、颜色、性质及有无皮损情况进行观察，记录过敏反应等异常反应，同时观察有无全身性反应如休克、晕厥、行为异常等［7，9］。统计两组实验动物中过敏例数，按过敏率（%）=［过敏反应例数/样本数］×100%公式计算各组过敏率，评估过敏反应情况。

2.2.2试验结果激发接触后72 h内，伤科敷液涂剂组未见任何皮肤异常、生理活动异常、行为异常动物，无致敏动物，致敏率为0%。阳性对照组激发接触后，2只实验动物15 min内出现皮肤水肿、皮疹等皮损表现，评分分别为2分×2分和1分×1分，均为轻度水肿；同时在给药后2～6 h，阳性对照组动物出现严重过敏反应6只，评分分别为3分×6分（3只）、3分×2分（1只），1×3分（1只）；阳性对照组实验动物过敏反应约在24 h后显著好转，48 h后基本消退，评分显著下降；72 h后总评分为9分。试验结果表明，伤科敷液涂剂对豚鼠皮肤无致敏作用，见表2。

表2　豚鼠的皮肤过敏性试验（n=10）

表3　中国家兔的皮肤刺激性试验（n=10）

2.3皮肤刺激性试验

2.3.1试验方法取白色中国家兔40只，雌雄各半，随机分为4组（n=10），伤科敷液涂剂高、中、低浓度组（分别为临床用药浓度的9倍、3倍、1倍）和空白对照组（给予生理盐水）［2-3］。完整皮肤试验：每组为5只动物，剃毛干预方法、药物浓度，脱毛面积同急性皮肤毒性试验，但是家兔两侧背部均作剃毛处理，采用左右两侧皮肤作对比对照。剃毛后然后静置不干预保持24 h，两侧常规消毒后，左侧涂受试药物，右侧涂生理盐水，6 h后生理盐水彻底洗除，涂药1次/d，持续3 d，对皮肤稳定、颜色、性质及有无皮损情况进行观察，观察时间为第24、48、72 h［4-5］。破损皮肤试验：同样每组取5只家兔，剃毛干预方法、药物浓度，脱毛面积同上，两侧剃毛区均用细砂纸作损伤模型，立即按要求涂抹药物同上，评价受试物的皮肤刺激性强度［6-7］。平均刺激性指数=（刺激反应分值/动物总数）。

2.3.2试验结果家兔完整皮肤试验无刺激性，破损皮肤试验结果有轻度刺激性，高剂量组、中剂量组损伤皮肤刺激指数达到0.6、0.3，用药后48～72 h缓解痊愈为0.3和0，涂药区与空白对照区差异统计学意义（P＞0.05），平均刺激性指数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3　结语

伤科敷液涂剂治疗骨折挫伤的临床研究是山东省中医药科技发展计划项目，该研究进行了急性皮肤毒性试验，中国家兔完整皮肤和破损皮肤均未观察到明显急性毒性；皮肤过敏性试验表明：阳性对照组激发接触后，仅2只实验动物15 min内出现皮肤水肿、皮疹等皮损表现，均为轻度水肿；给药后2～6 h，仅出现严重过敏反应6只，评分分别为3分×6分（3只）、3分×2分（1只），1分×3分（1只），阳性对照组实验动物过敏反应约在24 h后显著好转，48 h后基本消退，无明显过敏按压。在伤科敷液涂剂对家兔急性皮肤毒性试验，在皮肤完整和破损两种状态下，均未见皮肤毒性反应；伤科敷液涂剂对豚鼠皮肤过敏性试验，未见明显过敏反应。在伤科敷液涂剂对家兔皮肤刺激性试验中，家兔完整皮肤试验无刺激性，破损皮肤试验高剂量组、中剂量组损伤皮肤刺激指数达到0.6、0.3，用药后48～72 h缓解痊愈为0.3和0，其他组刺激指数均为0，涂药区与空白对照区差异无统计学意义（P＞0.05），刺激性较小，由此可知伤科敷液涂剂经皮肤用药无明显毒性，安全性良好。

当前，关于伤科敷液涂剂的药效学研究已经完成，伤科敷液对静脉注射葡聚糖致小鼠耳廓微循环障碍模型有显著改善作用、对组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高模型有显著抑制作用，对热板法、扭体法致小鼠疼痛模型，均可显著提高小鼠的痛阈值；对透明质酸酶致大鼠足跖肿胀急性炎症模型、大鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型，均有显著抗炎作用。国内临床研究发现［8-9］，伤科敷液涂剂体外培养证实对常见致病菌有抑菌作用，对于损伤皮肤具有活血化瘀、消肿定痛、抗炎作用，外用皮肤实验无明显刺激性和毒性，为临床应用提供了药效学依据，与该次研究结果一致。此外，国内文献研究采用随机单盲法，所有纳入样本按就诊顺序随机分为观察组或对照组，从临床应用效果和实验室检测结果两方面观察伤科敷液涂剂在治疗骨折挫伤中消肿、止痛、祛瘀的效果和安全性，结果表明，伤科敷液涂剂治疗骨折挫伤所致的肿胀、疼痛、瘀斑和活动受限等临床疗效显著，且未发现不良反应，也证明了伤科敷液涂剂的安全性［10-11］。

综上所述，伤科敷液涂剂动物实验表明经皮肤给药无明显皮肤毒性，刺激性较小，安全性良好，但仍需深入进行临床相关研究，以证明应用安全性。

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Dermal Toxicity and Safety Studies of Shangkefuye Paint

KONG Qing-min，ZHANG Yan
Jining City Yanzhou District Chinese Medicine Hospital，Yanzhou，Shandong Province，272100 China

Objective Skin toxicity and safety of Paint shangkefuye after skin administration.Methods During the period of May 2014 and March 2015 choose clean（white hair）in rabbits and guinea pigs（DHP）as experimental animals，the rabbit skin acute toxicity test，skin of guinea pig allergic test and rabbit skin stimulus test，the injury research of deposited liquid paint with skin medication acute toxicity，allergic，irritant.Results Trauma dressing liquid paint on rabbits with acute skin toxicity test and in skin integrity and damage state under.There were no toxic skin reaction；Apply liquid paint on the skin of guinea pig Department of Traumatology allergic test，no allergic reaction；Rabbit skin integrity test has no irritation，damaged skin test in high dose group，middle dose group damage the skin stimulation index reached 0.6，0.3，medication after 48～72 h ease recovery is 0.3 and 0.Other groups stimulation index was 0，the applicator zone and a blank control had no significant difference（P＞0.05）.Conclusion Shangkefuye Paint medication through the skin without significant acute dermal toxicity，good safety.

Shangkefuye Paint；Skin toxicity；Skin irritation；Skin irritation

R965.3

A

2096-1782（2016）09－0008-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.008

2016-06-15）

山东省中医药科技发展计划项目课题，项目编号：2011-283。

孔庆民（1964.3-），男，山东济宁人，大专，副主任药师，主要从事中药新制剂的研究与应用，E-mail：15092755086@163.com。