荧光猝灭法溶解氧传感器实验室校准方法研究

郑旻辉，潘建明，杨俊毅，谢尚微

（1.中国地质大学（武汉）资源学院，湖北　武汉 430074；2.国家海洋局海洋生态系统与生物地球化学重点实验室，国家海洋局第二海洋研究所，浙江　杭州 310012）

荧光猝灭法溶解氧传感器实验室校准方法研究

郑旻辉1，2，潘建明2，杨俊毅2，谢尚微2

（1.中国地质大学（武汉）资源学院，湖北武汉 430074；2.国家海洋局海洋生态系统与生物地球化学重点实验室，国家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012）

针对我国目前缺乏荧光猝灭法光学溶解氧传感器校准方法的现状，以AADI 4330F溶解氧传感器为实验对象，提出了一种适用于所有荧光猝灭法光学溶解氧传感器的实验室校准方法。该方法使用一个能够精确控制水体温度的自制校准装置，通过改变通入容器的氧气和氮气比例来控制容器内的溶解氧含量，在4个温度下分别测定至少10组水体温度值、传感器相位值和Winkler碘量法测定值数据，使用回归分析进行多项式拟合获取传感器校准系数。经过实验室验证，在校准试验温度范围内随机温度和溶解氧浓度下，使用该方法校准后传感器测定值与标准值偏差在±5 μmol/L以内，达到了仪器自身的准确度水平。本方法在校准结果准确度和温度适用范围等方面都明显优于两点校正法，表明该方法具有良好的校准效果和推广应用价值。

溶解氧传感器；荧光猝灭；实验室校准方法

近年来我国近海低氧等生态环境问题日趋严重［1-2］，引起了科学家们的极大关注，对于海洋生态环境长期过程监测也提出了新的技术要求。基于荧光猝灭原理的光学溶解氧传感器［3-4］比电化学法传感器［5-7］有着更好的数据长期稳定性，代表了当前海水溶解氧原位测量技术的主要发展方向，近年来获得了迅速发展。光学溶解氧传感器在海上长期使用过程中，由于膜受光分解、生物附着等原因会产生数据漂移（图1），需要进行数据校准以维持测值准确度。目前一般使用的是两点校准法，即分别制备无氧水和溶解氧饱和水用于传感器校准，以实验温度下计算获得的理论溶解氧含量作为基准值进行两点线性校准。该校准方法基准值少，校准结果偏差大，难以满足低氧过程研究、深海底原位培养研究等科研工作对于高精度溶解氧数据的需求。

图1　长时间使用后荧光猝灭法溶解氧传感器数据漂移情况

目前我国在光学溶解氧传感器研制方面取得了一些进展，合肥工业大学、南京信息工程大学电子与信息工程学院、浙江大学等单位都独立研发了荧光猝灭传感器样机［8-10］，然而在传感器标定方法方面还十分欠缺。此前潘忠泉等［11-12］在微量溶解氧分析仪校准装置研制方面开展了一些研究工作，分别设计了基于法拉第电解反应原理［11］和基于解吸原理［12］的微量溶氧仪校准装置。前者需要采用氧化还原树脂、法拉第电解装置，系统过于复杂；后者装置的精度受制于氮氧混合气体氧含量的不确定度及气体在纯水中的溶解程度。上述装置在校准范围、校准精度等方面都无法满足当前荧光猝灭法光学溶解氧传感器的校准要求。本文以AADI 4330F溶解氧传感器为实验对象，旨在建立一种适用于所有荧光猝灭法光学溶解氧传感器的实验室校准方法，为提高光学溶解氧传感器数据质量提供技术支撑，同时也为我国光学溶解氧传感器的计量标定工作提供方法依据。

1　材料和方法

1.1传感器工作原理及数据处理

本文使用的挪威AADI公司生产的Oxygenoptode是目前最先进的荧光猝灭法溶解氧传感器之一，体积小、精度高，广泛应用于ARGO浮标剖面监测［13］、深海原位培养观测实验［14］、海洋生态群落净生产力［15］、海洋底层界面通量测量［16］、走航溶解氧连续观测［17］等领域。基于荧光猝灭原理的AADI 4330F溶解氧传感器使用一种铂金卟啉（platinum porphyrine）的特殊分子作为发光基团，该发光基团受到蓝光照射时会被激发，在一段时间内发出红光并返回到初始状态。当有O2存在时，发光基团会转移部分被激发的能量到与之相碰撞的氧分子上，使发出红光的时间缩短。O2浓度和发光衰减时间之间的关系符合Stern-Volmer方程：

式中：τ为衰减时间；τ0为无氧状态衰减时间；KSV为Stern-Volmer常数（淬灭效率）。

由于发光衰减时间受诸多因素影响，同时发光衰减时间与相位之间具有一定的关系，因此也可以在相位和O2浓度之间建立直接的关系。O2浓度与相位、温度间具有以下关系［18］：

式中：［O2］为水体中溶解氧浓度，μM；P为仪器相位值；C0，C1，C2，C3，C4为温度的系数，与温度符合如下关系［18］：

式中：x=0，1，2，3，4；t为温度，℃；C00，C01......C42，C43为传感器标定系数。

1.2校准装置设计

由传感器数据计算公式可知，温度是光学溶解氧传感器最重要的影响因素，因此在实验过程中精准控制水体温度是保证校准效果的关键。本文构建了一套校准装置（图2），其主体为一个密闭的有机玻璃容器，在桶壁预留了气体入口和气体出口，前者同时作为碘量法取样口；在容器内安置水泵用于水体搅拌；水体温度由可控温水浴循环系统来精确控制。试验时，在容器内尽量装满水，确保传感器充分浸没水中，并且与四周保持足够距离。

图2　校准装置示意图

1.3校准步骤与数据处理方法

安装好校准装置和待校准传感器后，根据传感器实际应用环境温度范围选定4个校准温度（温度1、温度2、温度3、温度4）。设定恒温水浴温度为温度1，待温度稳定后开始试验。通过改变通入容器的氧气和氮气比例来控制容器内的溶解氧含量，使氧饱和度保持在0～120%之间。使用传感器实时数据来判断容器内溶解氧波动情况，待读数稳定在±0.1%且持续3～5 min后，记录传感器相位值、温度值，同时从采样口取水样使用Winkler法进行测定，在一个温度试验中获取至少10组溶解氧含量数据。完成温度1试验以后，依次进行其他3个温度的试验。

根据校准试验中获取的4个温度下多组溶解氧相位值、水温和Winkler法测定值来计算传感器的校准系数。在4个温度下，分别对Winkler法测定值与传感器相位值做四项式曲线拟合，获得该温度下的C0'，C1'，C2'，C3'，C4'；再根据式2进行矩阵计算获取校准系数C00'，C01'......C42'，C43'。

1.4传感器校准系数获取

以安德拉4330F溶解氧传感器（序列号795，出厂标定时间2012年1月，准确度8 μmol/L或5%）为试验对象，设定试验水温为5℃，10℃，15℃，20℃，按照上述校准步骤进行试验，获得试验数据（表1）。

表1　4个温度下传感器相位值和Winkler法测定值

按照上述数据处理方法获得传感器校准系数（表2）。

表2　传感器校准系数

2　结果与讨论

2.1传感器校准效果验证

2.1.1校准方法系统偏差分析使用校准试验获取的传感器校准系数，结合试验中记录的传感器相位值和水温，计算传感器校准值，与Winkler法测定值进行对比，可了解校准方法本身的系统偏差。由表3及图3可以看出，传感器校准值与Winkler法测定值较为一致。全部44组数据中，校准值与基准值最大偏差为-4.58 μmol/L，所有偏差均在±5 μmol/L以内，小于传感器标称准确度（8 μmol/L）。上述数据表明，使用该校准方法拟合计算获得的校准系数较为合理，能够在较大温度范围内准确反映溶解氧含量与传感器相位值、温度之间的关系，从而确保根据校准系数计算得到的传感器测值具有较高准确度。

表3　传感器校准值与Winkler法测定值对比（单位：μmol·L-1）

图3　传感器校准值与Winkler法偏差

2.1.2校准系数适用范围验证为了验证校准系数在温度和溶解氧浓度的适用范围，使用校准装置在校准温度范围内的数个随机温度和溶解氧含量下进行试验，记录传感器相位值和水温，使用校准系数计算传感器校准值，并与Winkler法测定值进行比较。数据结果（表4及图4）显示，传感器校准值与Winkler法测定结果对比偏差均在±5 μmol/L以内（最大偏差为-4.93 μmol/L），明显小于传感器原始测值的误差范围（最大偏差为-26.24 μmol/L）。这一结果表明本方法在校准范围内具有普遍适用性，确保通过有限的4个温度、每个温度10个浓度试验获取的校准系数能够扩展应用于校准范围内其他任意温度和浓度。

表4　随机温度和溶解氧含量下传感器值与Winkler值对比

图4　校准系数验证结果

2.2本方法与两点校准法的对比

2.2.1传感器两点法校准公式获取按照两点校正法对传感器进行无氧水及饱和溶解氧水两点校正试验。由于该方法仅需进行一个温度条件的试验，且对温度设定没有特殊要求，本次实验将温度设定为20℃。使用5 L大烧杯装满自来水放于20℃的恒温水域中，并用鼓气泵向水中连续鼓入空气24 h以上，制备饱和溶解氧水；用另一大烧杯装满自来水放于20℃恒温水域中，加入过量的无水亚硫酸钠（Na2SO3），制备无氧水。使用AADI 4330F溶解氧传感器测定饱和溶解氧水结果为263.49 μmol/L，测定无氧水的结果为0.84 μmol/L。查询传感器使用手册中的水中氧溶解度表格［18］可知该温度条件下溶解氧饱和水浓度为283.9 μmol/L。根据以上数据计算得到传感器两点法校准公式为：y=1.0809x-0.9091。

2.2.2本方法与两点法的校准结果对比分别采用两点校准公式和本方法校准系数对校准试验中5℃和20℃条件下测得的数据进行校准，对比两点校准法与本方法的差异。从结果（表5及图5）可以看出，5℃时传感器两点校准值与Winkler法测定结果对比最大偏差为-13.14 μmol/L，小于传感器原始测值的误差范围（最大偏差为-28.11 μmol/L），大于本方法校准后的偏差（最大偏差为1.44 μmol/L）；20℃时传感器两点校准值与Winkler法测定结果对比最大偏差为11.98 μmol/L，小于传感器原始测值的误差范围（最大偏差为-22.28 μmol/L），大于本方法校准后的偏差（最大偏差为3.31 μmol/L）。

上述结果表明，在两个温度条件下通过两点校准法校准以后，都能够缩小传感器测定数据误差，但是两点法校准效果与本方法相比仍然存在较大差距。此外，与本方法校正系数能够适用于较广温度范围不同，两点校准法受温度影响较大。5℃和20℃条件下校准结果存在较大差异，表明使用单一温度获取的两点校准公式在其他温度下使用时会带来较大误差。

图5　5℃和20℃两点法与本方法校准结果对比

3　小结

（1）实验数据表明，在实验条件温度范围内使用本方法校准以后，所有溶解氧传感器测定值与标准值偏差均在±5 μmol/L以内，小于传感器自身标称准确度，说明本校准方法具有较好的校准效果；

（2）与两点校准法进行对比分析后表明，本方法校准结果明显优于一般使用的两点校准法，且本方法受温度影响小，适用范围更广；

（3）本校准方法根据荧光猝灭法溶解氧传感器的工作原理进行数据处理，理论上可以适用于所有基于该原理的溶解氧传感器校准，同时本方法中使用的校准装置经过改进后也可用于其他类型的溶解氧、二氧化碳、甲烷等溶解性气体传感器的实验室校准工作，具有极大的推广应用价值。

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Study on the Method for Laboratory Calibration of Dissolved Oxygen Sensors Based on Fluorescence Quenching

ZHENG Min-hui1，2，PAN Jian-ming2，YANG Jun-yi2，XIE Shang-wei2
1.Faculty of Earth Resources，China University of Geosciences，Wuhan 430074，Hubei Province，China；
2.Laboratory of Marine Ecosystem and Biogeochemistry，SOA，Second Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Hangzhou 310012，Zhejiang Province，China

Recently，oxygen sensors have been widely used in marine research，especially in studying the mass transfer rate of O2across the sediment-water interface，net community production of deep ocean and hyperbaric trap-respirometer for the capture and maintenance of deep-sea organisms.Most currently deployed oxygen sensors drift for months on the surface ocean and must be calibrated to maintain their accuracy.Focused on the fact that calibration methods for dissolved oxygen sensors based on fluorescence quenching are absent in China，this paper，with the the AADI 4330F dissolved oxygen sensor as the object of study，presents an oxygen calibration system designed to work in the laboratory using Aanderaa optode oxygen sensors.This method uses a self-made calibration apparatus that can accurately control the water temperature and regulate the dissolved oxygen content in the container through adjusting the O2/N2ratio.At least 10 groups of water temperature values，sensor phase values and Winkler titration values are measured under 4 temperatures，and the sensor calibrating coefficient is obtained through polynomial fitting with regression analysis.Laboratory validation proves that，under the random temperature and dissolved oxygen level within the calibrating temperature scope，the deviation between the measured values and standard values is well within±5 μmol/L with the use of this method，achieving the precision requirement.The presented method obviously precedes the two-point calibrating method in the aspects of result accuracy and temperature range，and thus has good calibrating effects and application value.

dissolved oxygen sensor；fluorescence quenching；laboratory calibration method

TP212；X834

A

1003-2029（2016）01-0062-06

10.3969/j.issn.1003-2029.2016.01.010

2015-06-14

国家高技术研究发展计划（“863”计划）资助项目（2012AA092102）；海洋公益性行业科研专项经费资助项目（200905025，201305012）；浙江省自然科学基金资助项目（LQ16D060006）

郑旻辉（1984-），男，助理研究员，主要研究方向为海洋生态环境监测技术。E-mail：zhengmh@sio.org.cn