响应面法优化棉花黄萎病拮抗菌Bacillus axarquiensisTUBP1产抗菌蛋白发酵条件研究

马江锋　曾 红

(1 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团农业技术推广总站， 新疆 乌鲁木齐 830011)



响应面法优化棉花黄萎病拮抗菌Bacillus axarquiensisTUBP1产抗菌蛋白发酵条件研究

马江锋1,2曾 红1*

(1 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)(2 新疆生产建设兵团农业技术推广总站， 新疆 乌鲁木齐 830011)

本实验拟采用Plackett Burman(PB)试验设计筛选出影响Bacillus axarquiensis TUBP1产抗菌蛋白关键因素，并采用响应面设计中Box-Behnken(BB)实验设计对其产抗菌蛋白最佳配比进行优化。本文使用Plackett Burman设计对影响B. axarquiensis TUBP1产抗菌蛋白的8个因素进行筛选，得到影响抗菌蛋白产量显著的因素为葡萄糖、蛋白胨和发酵pH。在此基础上进一步采用Box-Behnken设计对这3个显著因素的最佳配比进行优化，得到葡萄糖、蛋白胨、pH最佳配比为葡萄糖2. 53%、蛋白胨1.76%和pH7. 17，与优化前相比蛋白产量提高了34. 55%。

B. axarquiensis TUBP1； 响应面法； 抗菌蛋白； 发酵条件

棉花黄萎病影响棉花的产量和质量，也直接影响产棉地区农民经济收入，其是由半知菌亚门大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的维管束真菌性病害[1-2]。目前针对棉花黄萎病的防治常规方法有化学防治、农业措施以及培育抗病品种等手段，但是没有明显的防病效果。“以菌治菌”的生物防治因其无污染、无残留、不易使植物病原菌产生耐药性、生产工艺及流程简单等特点，以及有些生防菌还能促进农作物生长，倍受许多研究学者青睐[3-4]。

生防菌种类有放线菌[5]、霉菌[6]、细菌[7-9]，不同生防菌作用机理也有所不同，其中产生次生代谢抗菌产物达到抗菌作用是生防机理之一，据报道有subtilin、plipastatin、subtilosin、fengycin、sunlancin、surfactin、iturin等抗菌物质从芽孢杆菌中分离得到。本实验室从新疆南疆棉田土壤中分离得到的阿萨尔基亚种(Bacillus axarquiensis TUBP1)对新疆连作棉田棉花黄萎病有抑制作用，其田间生防效果可达43. 07%[10]，针对B. axarquiensis TUBP1分类学地位有零星报道[11]，而对此菌代谢产物及代谢产物发酵条件未见相关报道。前期试验表明其抗菌活性成分主要是以胞外蛋白为主，针对其抗菌蛋白发酵条件研究国内外尚未见文献报道。因此，基于前期研究基础上，本试验采用Plackett Burman、Box-Behnken优化B. axarquiensis TUBP1产蛋白发酵条件，提高其次生代谢产物产量，为进一步开发其作为生防菌进行小规模生产及发酵奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌种

植物病原菌：大丽轮枝菌 (V. dahliae Kleb ACCC36211)

生防菌TUBP1分离于新疆农一师12团棉田土壤并通过生理生化和分子学手段鉴定为B. axarquiensis TUBP1[11]，且生防效果可达 43. 07%，以上病原菌及拮抗菌均由塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室提供。

1.1.2供试培养基配方

NB培养基：5 g NaCl，10 g蛋白胨，20 g葡萄糖，5 g牛肉膏，1 000 mL蒸馏水

发酵培养基：NB基础培养基(根据表2中配方进行配制)

1.2方法

1.2.1拮抗菌B. axarquiensis TUBP1种子液的制备

将60 mL配置的NB培养基装于250 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min后，每瓶接种2 mL拮抗菌B. axarquiensis TUBP1，37 ℃、180 r/min，培养24 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2拮抗菌B. axarquiensis TUBP1发酵液制备和抗菌蛋白含量测定

50 mL发酵培养基接种2 mL B. axarquiensis TUBP1种子液，置于恒温震荡培养器，37 ℃、180 r/min条件下，培养48 h，5 000 g离心20 min，收集发酵上清液 4 ℃冰箱保存备用。

发酵上清加入80%饱和度的硫酸铵。置于4 ℃冰箱沉淀过夜，5 000 g离心20 min，弃上清液收集沉淀，用磷酸缓冲液PBS(pH 7. 2)进行溶解，装于截流分子量为8 000～14 000的透析袋中，置于4 ℃冰箱透析过夜。透析袋里蛋白质溶液用微孔滤膜过滤(Φ=0. 22 μm)除去杂质，并用考马斯亮蓝法测蛋白质含量[12]。1.2.3Plackett-Burman试验设计及Box-Benhnken设计优化发酵条件

Plackett-Burman(PB)试验设计，利用Design Expert.8.0 软件将B. axarquiensis TUBP1发酵培养的8个条件(蛋白胨、葡萄糖、初始pH、氯化钠、转速、接种量、温度、装液量)分别作为PB试验的因素，采用试验次数N=12的试验设计，各因素分别取2个水平，如表1所示。然后按照PB试验设计并采用考马斯亮蓝法测胞外蛋白含量[12]，以期找出影响B. axarquiensis TUBP1产胞外蛋白含量最显著的因素。

Box-Benhnken(BB)试验设计优化发酵条件，根据PB试验确定的因素和水平，采用BB试验设计对B. axarquiensis TUBP1产胞外蛋白条件进行3因素3水平的响应面分析试验。得出影响B. axarquiensis TUBP1胞外蛋白含量的最佳发酵条件。

1.2.4B. axarquiensis TUBP1产胞外蛋白发酵条件验证实验

经响应面法中BB试验设计优化得到B. axarquiensis TUBP1产胞外粗蛋白发酵条件，重复6次实验检验B. axarquiensis TUBP1产胞外蛋白发酵条件，与理论产胞外蛋白相比较，检验模型的有效性。

表1　Plackett-Burman试验因素水平及编码

表2　Placketts Burman实验设计及结果

2　结果与分析

2.1培养基中氮源、碳源、无机盐筛选结果

在实验前期已成功筛选出了最佳氮源为蛋白胨、最佳碳源为葡萄糖、最佳无机盐为氯化钠。

2.2Plackett Burman实验结果

基于前期实验结果，对影响B. axarquiensis TUBP1产抗菌蛋白的8个因素(葡萄糖、pH、氯化钠、装液量、接种量、转速、温度)一起进行考察，每个因素考察2个水平，以蛋白含量为响应值，试验因素如表1所示，PB试验设计和试验结果如表2所示，PB方差分析如表3所示，由表3可知，试验模型极显著(p<0. 01)，说明PB试验设计适合优化B. axarquiensis TUBP1产蛋白质发酵条件。由PB方差分析表，得到影响B. axarquiensis TUBP1产蛋白含量最为显著的三个因素分别为：A(葡萄糖)、B(蛋白胨)和C(初始pH)。

表3　Plackett Burman方差分析

续表3

来源平方和均方F值P值显著性EG2.402.402.030.3914EH1.131.134.730.4493FG0.830.830.910.0616FH0.620.621.020.9021GH0.080.083.530.5102A23.363.364.120.0007**B21.511.510.560.0041**C21.491.490.370.0016**D20.030.032.830.0544E20.380.383.840.0627F22.272.2711.780.3724G210.8810.886.790.1728H24.304.302.930.0822残差27.3490.34失拟项18.934.921.390.5437

注：**. P<0. 0 1为差异极显著；*. P<0. 0 5为差异显著

2.3Box-Behnken响应面分析的实验结果

表4　响应面三因素三水平试验设计

表5　Box-Behnken设计及结果

续表5

试验号A-葡萄糖%B-蛋白胨%C-pH蛋白质含量μg/mL600020.4270-1-120.3180-1113.909-11017.301001115.701110-117.431201-120.101300020.50141-1015.301500020.601600020.501710113.62

基于PB 试验结果分析基础上，对影响蛋白含量的主要3个因素，葡萄糖、蛋白胨和pH进一步采用BB试验设计进行发酵条件的优化，试验三因素(葡萄糖、蛋白胨和pH)三水平及编码见表4，试验设计及结果分析见表5，PB方差分析如表6所示，由表6可知，试验模型极显著(p<0. 01)，由此可说明BB试验设计适合对影响B. axarquiensis TUBP1产蛋白质最显著的3个因素(葡萄糖、蛋白胨和pH)进行最佳配比优化。

2.3.1响应面方差分析结果

表6　响应面回归模型方差分析

R2=0. 972 0;Adj R-Squared=0. 943 9; Adeq Precision=13. 274

注：**. P<0. 0 1为差异极显著；*. P<0. 0 5为差异显著

利用Minitab 16软件对BB试验结果进行二次多项回归方程拟合，获得拮抗细菌B. axarquiensis TUBP1发酵抗菌蛋白对蛋白胨、葡萄糖和pH的多元二次回归方程:Y=44. 112 7+0. 975 3A+0. 070 5B-2. 045 0C+0. 146 5AB-1. 60 71AC-0. 308 7BC-0. 218 4A2-0. 085 7B2-2. 461 3C2

式中：Y为抗菌蛋白含量，A为葡萄糖，B为蛋白胨，C为pH，根据回归方程得出最佳的拮抗蛋白含量为20. 93 μg/mL。

由表6可知，P值的大小可以判断各因素对拮抗菌B. axarquiensis TUBP1产蛋白影响的强弱。P值越小，对产蛋白影响作用越强。拮抗菌B. axarquiensis TUBP1发酵液产蛋白的影响程度大小的次序为pH(C)>葡萄糖(A)>蛋白胨(B)。

2.3.2响应面图分析

响应面图形是响应值Y对应与实验因素X1、X2和X3(X1为葡萄糖，X2为蛋白胨，X3为pH)所构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高线图，其可以直观的反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响，结果见图1至图3。

图1　蛋白胨和葡萄糖对B. axarquiensis TUBP1菌株产蛋白含量影响的响应面和等高线图

图2　葡萄糖和pH对B. axarquiensis TUBP1产蛋白含量影响的响应面和等高线图

图3　蛋白胨和发酵pH对B. axarquiensis TUBP1产蛋白含量影响的响应面和等高线图

由图1可知，随着葡萄糖和蛋白胨含量的逐渐增大，B. axarquiensis TUBP1产拮抗蛋白含量由高变低，由此可知，适当的增大葡萄糖和蛋白胨含量，可以在一定程度上提高该菌株所产蛋白质的含量。由图2可知，随着pH的增大与葡萄糖浓度的提高，菌株产生蛋白质也是表现为由高变低。在图3中，pH的适当增大及蛋白胨含量的增加对菌株产蛋白的影响与图2的响应面图形相似，通过对该模型方程的求解及其模型验证试验得知，棉花黄萎病拮抗菌B. axarquiensis TUBP1最优的发酵条件为葡萄糖2. 53%、蛋白胨1. 76%和pH7. 17。因此，在实际操作中，应适当控制蛋白胨、葡萄糖的含量及pH值，以获得B. axarquiensis产较高的蛋白质。

2.4B. axarquiensis TUBP1产抗菌蛋白最佳工艺条件验证实验

进一步通过重复试验验证结果准确性，结果如表7所示，由表7可以看出，在最佳工艺条件下，B. axarquiensis TUBP1菌株产生的拮抗蛋白平均值实际上可达20. 91 μg/mL，实际值与预测值相接近，且重复性良好，由此可以说明B. axarquiensis TUBP1产抗菌蛋白条件优化结果可靠可行。

表7　B. axarquiensis TUBP1产抗菌蛋白最佳工艺条件验证结果

3　讨论

拮抗菌的次生代谢产物是其主要抗菌方式之一，影响抗菌物质产生的因素有碳源、氮源和无机盐等，传统方法是先进行单次单因素试验，再采用正交试验确定单因素的最佳组合，此方法仅能在确定单因素基础上，比较已选定的水平的好坏，而并非获得最佳的优化条件[13]。Plackett-Burman设计是从许多影响代谢产物产量的变量间快速筛选出主要因素，再通过与响应面方法结合确定这些主要因素最佳水平，此方法可以弥补以前在微生物培养条件优化中的一些不足。许多学者通过用此方法提高了微生物次生代谢产物[14-15]。

本课题组对已分离棉花黄萎病菌拮抗菌株B. axarquiensis TUBP1抗菌活性成分分析，初步确定为胞外蛋白，有望开发成新型农用抗棉花黄萎病菌药物。为提高B. axarquiensis TUBP1发酵产抗菌蛋白的能力，本研究首先通过用PB设计对影响B. axarquiensis TUBP1产蛋白的8个因素(葡萄糖、pH、氯化钠、装液量、接种量、转速、温度)进行考察，并利用Minitab 16软件筛选出了关键因素为葡萄糖、蛋白胨和pH，并通过响应面法中BB试验设计对发酵条件中的葡萄糖、蛋白胨和pH进行优化，获得B. axarquiensis TUBP1产蛋白最优条件，进一步验证最优条件，实验重复值与预测值拟合良好。

4　结论

本实验用Plackett-Burman实验设计筛选出棉花黄萎病拮抗菌B. axarquiensis TUBP1抗菌蛋白发酵条件中的关键因素为葡萄糖、蛋白胨和发酵pH。并通过全因子中心组合实验设计和响应面法，明确其最佳配比为葡萄糖2. 53%、蛋白胨1. 76%和pH7. 17。在此条件下，得到抗菌蛋白含量最高为20. 91 μg/mL，与优化前相比蛋白产量提高了34. 55%。

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Optimizing Fermentation Conditions of Antagonistic Bacillus axarquiensis TUBP1Against Verticillium dahlia by Response Surface Method

Ma Jiangfeng1,2Zeng Hong1*

(1 Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Xinjiang Production and Construction Group/College of Life Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)(2 Institute for the Control of Agrochenicals, Xinjiang Production and Construction Group, Urumqi, Xinjiang 830011)

To improve and optimize antifungal protein production by a newly isolated B. axarquiensis, Plackett-Burman (PB) design and Box-Behnken design (BB) were adopted in culture conditions, the PB design was undertaken to evaluate the effects and Box-Behnken design was used to optimize the critical internal factors.The results showed that, the peptone, glucose and pH were the key factors, the optical concentration of the variables were determined as glucose at 2.53%, peptone at 1.76% and pH at 7.17. Protein yield increased by 34.55% compared with before optimization.

B. axarquiensis TUBP1; response surface method; antifungal protein; fermentation conditions

2015-06-18

国家自然科学基金(31260013)；新疆生产建设兵团博士基金(2013BB006)；塔里木大学校长博士基金(TDZKBS201206)。

马江锋(1982-)，男，研究方向为植物保护。E-mail：30768050@qq.com

*为通讯作者E-mail：zenghong0705@163.com

1009-0568(2016)01-0005-09

TQ92

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.01.002