柴胡皂苷d联合黄芩苷对大鼠缺血/再灌注损伤中Th1/Th2平衡的影响

董利平　崔玉环　赵宝民　连晶晶　魏玉磊　颜　娟　郑茂东　刘占矿

(河北北方学院附属第一医院老年科，张家口　075000)



柴胡皂苷d联合黄芩苷对大鼠缺血/再灌注损伤中Th1/Th2平衡的影响

董利平崔玉环赵宝民连晶晶1魏玉磊2颜娟3郑茂东3刘占矿

(河北北方学院附属第一医院老年科，张家口075000)

目的探讨柴胡皂苷d联合黄芩苷对大鼠缺血/再灌注损伤中Th1/Th2细胞平衡的影响。方法采用线栓法建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，将健康雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组，按再灌注不同时间点分为6、12、24、48、72 h五个亚组；应用单细胞凝胶电泳技术检测单、双链DNA断裂损伤率，酶联免疫法(ELISA)测定Th1/Th2比值。结果脑缺血/再灌注后存在细胞DNA断裂损伤，给予柴胡皂苷d+黄芩苷药物保护后其DNA损伤率降低(P<0.01)。缺血/再灌注后干扰素(INF)-γ/白介素(IL)-4比值增加(P<0.01)，并随缺血/再灌注时间延长呈动态变化，于24 h达最高峰，给予药物干预后比值降低，并于24 h表达最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最显著(P<0.01)。结论柴胡皂苷d联合黄芩苷可能是通过维持Th1/Th2细胞平衡实现其对大鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。

柴胡皂苷d；黄芩苷；Th1/Th2比值

在缺血性脑血管病发生发展及治疗过程中，脑缺血/再灌注损伤的病理生理过程起着重要的作用。研究证实Th1/Th2细胞失衡与缺血/再灌注损伤相关联〔1～4〕。本试验选取柴胡的主要活性成分柴胡皂苷d、黄芩的主要活性成分黄芩苷，探讨其在脑缺血/再灌注损伤中的神经保护机制。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组180只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，重量(250±10)g，购自北京大学医学部实验动物科学部，随机分成正常组、假手术组、模型组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组，每组30只，按再灌注不同时间点分为6、12、24、48、72 h五个亚组。

1.2药物与试剂柴胡皂苷d购自Sigma-Aldrich公司；黄芩苷购自Sigma-Aldrich公司；栓线购自北京沙东生物技术有限公司，试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；大鼠白介素(IL)-4、干扰素(INF)-γ ELISA检测试剂盒购自Biosource公司。

1.3制备脑缺血/再灌注损伤大鼠模型大鼠称重，腹腔注射麻醉7%水合氯醛(5 ml/kg)，采用改进Longa线栓法，暴露右侧颈外动脉并剪开，将栓线推至大脑中动脉开口处，阻断大脑中动脉血流，导致脑缺血，固定栓线，2 h后拉出栓线，恢复血液供应，完成脑缺血/再灌注损伤模型；假手术组不实施缺血再灌注，只进行手术。

1.4用药方法脑缺血/再灌注手术后2 h柴胡皂苷d组(70 mg/kg)、黄芩苷组(30 mg/kg)、柴胡皂苷d(70 mg/kg)+黄芩苷(30 mg/kg)组采用腹腔注射药物，正常组、假手术组及模型组给予等量生理盐水腹腔注射，各组均每天早晨给药1次。

1.5神经功能损伤评分动物清醒后，采用Longa评分标准进行系统评分：0分：行为正常；1分：对侧前爪轻微不对称，不能充分伸展；2分：行走时连续向外侧转圈；3分：颤抖不稳并跌倒，行走时向对侧倾斜；4分：意识丧失，不能行走；符合1～3分者大鼠纳入实验，其余剔除。

1.6单细胞凝胶电泳(Came assay)检测缺血/再灌注病灶中单、双链DNA断裂程度在相应时点断头处死大鼠，在冰盘上将缺血半球去除额极、枕极及矢状缝内侧各2 mm的大脑皮质和基底节，余脑组织匀浆，机械研磨法制备单细胞悬液，调细胞浓度为1×1012/L。制胶、裂解、电泳、EB染色，在荧光显微镜下观察细胞图像，每张玻片计数200个细胞中拖尾细胞(迁移距离>70 μm的细胞定位拖尾细胞)所占的百分数作为评价DNA单、双链断裂的指标。

1.7酶联免疫法(ELISA)测定血浆中Th1/Th2比值的情况取静脉血3 ml，常规分离血清，置-20℃冰箱待测。组织总蛋白溶解液及静脉血中Th1/Th2检测均按ELISA试剂盒内附说明书操作，以INF-γ/IL-4的比值反映Th1/Th2细胞平衡状态。

1.8统计学分析釆用SPSS13.0统计学分析软件对数据的组间比较行t检验。

2　结　果

2.1神经功能行为学评分正常组与假手术组的神经功能行为学评分为0。与模型组相比，药物干预组神经功能行为学评分有统计学意义(P<0.01)，柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最显著(P<0.01)。见表1。

2.2脑组织DNA单、双链断裂损伤程度与假手术组及正常组相比，模型组DNA损伤率明显升高(P<0.01)；与模型组相比，药物干预组明显下降(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最显著(P<0.01)。见表2，表3。

2.3Th1/Th2比值的情况与假手术组及正常组相比，模型组细胞因子INF-γ/IL-4的比值增加，提示机体存在免疫失衡，主要以Th1细胞因子表达异常为主；而给予药物干预后INF-γ/IL-4的比值降低，T细胞向Th1表型转化减少，提示可能通过特异性调节IL-4的基因表达，进而抑制INF-γ表达，阻止T细胞向Th1表型转化；且柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最显著(P<0.01)。见表4。

表1　脑缺血/再灌注后不同时间神经功能行为学评分±s,n=6)

与假手术组比较:1)P<0.01；与同时间模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　缺血/再灌注后不同时间脑组织的DNA单链断裂损伤率±s,%，n=6)

表3　缺血/再灌注后不同时间脑组织的DNA双链断裂损伤率±s,%，n=6)

表4　缺血/再灌注后不同时间血浆INF-γ/IL-4比值比较

3　讨　论

经典的Th1/Th2模式认为CD4+T细胞在受到抗原刺激后分化为2种表型：炎性反应效应细胞(Th1)和辅助性效应细胞(Th2)〔1〕。研究表明，CD4+T细胞参与了脑缺血/再灌注损伤过程〔2〕，在血流再通的早期阶段，T细胞活性被部分激活，导致组织损伤，虽然其机制尚未完全阐明，但很可能是通过Th1细胞分泌某些促炎性因子(IL-2、IL-12、INF-γ及TNF-α等)产生〔3〕；而Th2细胞可以通过分泌IL-4等抗炎性因子，实现对缺血脑组织的保护〔4〕，证实Th1/Th2细胞失衡与脑缺血/再灌注损伤相关联。从理论上讲，如果能够调节这种免疫失衡状态，就可以减少再灌注损伤，从而改善患者预后。

小柴胡汤原方是和解少阳而治疗半表半里证的传统方剂，后世医家扩展应用至内伤杂病。小柴胡汤以柴胡、黄芩这一对药为主药，两药配合，升降并行，从而旋转枢机，逆转疾病的病理生理过程。柴胡皂苷是柴胡主要有效成分，分为a、b、d、e、f、h，其中柴胡皂苷d 药理活性最强，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤，调解内分泌及免疫系统等多种生物学效应〔5〕，也表现出抑制NF-κB、NF-AT激活的T淋巴细胞和AP-1信号对抗增殖作用〔6,7〕。黄芩的主要活性成分黄芩苷是一种黄酮类化合物，具有抗凋亡、抗炎、免疫调节的作用〔8～10〕。

本研究结果表明MCAO大鼠短暂局灶性缺血/再灌注后缺血脑组织出现明显的DNA单、双链损伤，Th1/Th2失衡，而给予柴胡皂苷d+黄芩苷干预后，Th1/Th2失衡显著改善，证实柴胡皂苷d及黄芩苷同时给药可减轻脑梗死的缺血再灌注损伤，其机制可能与其维持Th1/Th2细胞平衡有关，为通过调节免疫、减少炎症损伤治疗脑梗死提供新的思路，为拓宽柴胡皂苷d联合黄芩苷在缺血/再灌注中的临床应用提供理论依据。

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3Xiong X,Barreto GE,Xu L,etal.Increased brain injury and worsened neurological outcome in interleukin-4 knockout mice after transient focal cerebral ischemia〔J〕.Stroke,2011;42(7):2026-32.

4Luo X,Kraus WL.On PAR with PARP:cellular stress signaling through poly(ADP-ribose)and PARP-1〔J〕.Genes Dev,2012;26(5):417-32.

5Zhu Z,Liang Z,Han R.Saikosaponin accumulation and antioxidative protection in drought-stressed Bupleurum Chinense DC〔J〕.Plant Environ Exp Bot,2009,66:326-33.

6Wong VKW,Zhou H,Cheung SSF,etal.Mechanistic study of saikosaponin-d(Ssd)on suppression of murine T lymphocyte activation〔J〕.J Cell Biochem,2009;107(2):303-15.

7Wong VK,Zhang MM,Zhou H,etal.Saikosaponin-d enhances the anticancer potency of tnf-alpha via overcoming its undesirable response of activating NF-kappa bsignalling in cancer cells〔J〕.Evid Based Compl Alternat Med,2013;2013:745295.

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〔2016-01-19修回〕

(编辑李相军)

河北省卫生厅科研基金项目(ZL20140035)

刘占矿(1963-)，男，主任医师，主要从事脑血管病研究。

董利平(1964-)，女，主任医师，主要从事脑血管病研究。

R743.3

A

1005-9202(2016)16-3918-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.022

1河北北方学院附属第一医院检验科

2河北北方学院附属第一医院心外科

3河北北方学院附属第一医院药剂科