华肖菝葜组织培养技术的初步研究

2016-10-24弓强王贵军

安徽农学通报 2016年16期

弓强　王贵军

摘要：为了更好地开发利用华肖菝葜，该研究以华肖菝葜幼嫩带芽茎段为外植体，以MS为基本培养基，研究了不同植物激素组合对华肖菝葜组织培养的影响。试验结果表明：外植体的最佳消毒方式为20%次氯酸钠消毒20min，最佳启动培养基为MS+6-BA6.0mg/L+NAA0.15mg/L+活性炭1 000mg/L，在启动培养基上培养25d左右诱导率达到76%。

关键词：华肖菝葜；组织培养；植物激素；外植体

中图分类号 R282.71 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）16-0027-03

Abstract：The aim of the research was to develop and utilize Heterosmilax chinensis Wang better. Taking the young stem of Heterosmilax chinensis Wang as the explant，using the MS as the basic culture medium，the effects of hormone combination on callus formation and plantlet regeneration of Heterosmilax chinensis Wang were studied in this paper. The results indicated that：The optimum disinfection method of explatrts was disinfecting with 20% sodium hypochlorite for 20 min.The optimum initial medium was MS+6-BA 6.0mg/L+NAA 0.15mg/L+activated carbon 1 000mg/L，with the induction rate being reach 76%，when cultivated in initial medium for 25d.

Key words：Heterosmilax chinensis Wang；Tissue culture；Plant hormone；Explant

华肖菝葜为百合科华肖菝葜（Heterosmilax chinensis Wang）或短柱肖菝葜（Heterosmilax yunnanensis Gagneb）的攀援灌木，主要产地为四川中部至东南部、云南东南部、广西西南部和广东北部。生于海拔300～2 100m的山谷密林中或灌丛下[1]。白土苓为华肖菝葜或短柱肖菝葜的干燥块茎，收载于《中华本草》，其味甘、淡，性平，具有清热利湿、解毒消肿等作用，用于小便淋湿、白浊、带下、痈肿消毒等症[2]。白土苓用药历史长，与中国药典收载的土茯苓不仅药名相近，而且历代本草常以同药名土茯苓记载。《本草纲目》[3]一谓“土茯苓有赤白2种，入药用白者良”，所称白者为白土茯苓，赤者为土茯苓。在我国很多地区常把白土茯苓作土茯苓使用，混用历史较悠长，市场上药材品种混乱，真伪难辨别[4]。最新研究表明，华肖菝葜提取物中含有β-谷甾醇、棕榈酸和硬脂酸[5-6]，在利尿、抗炎、抑菌、解毒、肿瘤抑制等方面具有显著作用[7]。

华肖菝葜入药部位根的生长年限较长，资源更新较慢。近年来，这一野生资源由于人们的过度挖掘，日益减少，加之其花序小，单性异株，种子难于采收[8-9]。华肖菝葜的繁殖主要依靠自然分蘖或实生繁殖，但分蘖能力及种子发芽率低，扦插或嫁接较难成活[10]。为了更好地开发利用保护这一野生资源，笔者对华肖菝葜的组织培养技术进行了初步研究。采用组织培养，可以快速获得大量无菌苗，对保护这一野生资源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料试验用的华肖菝葜外植体取自上午09：00—11：00当年萌生的健壮带芽茎段。试剂：蔗糖、琼脂、酒精、次氯酸钠、6-BA、NAA、HCl、活性炭，以上试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配制以MS培养基为基本培养基，根据实验需要添加其他物质（6-BA、NAA、活性炭等），定容至1 000mL，用1mol/LNaOH调节培养基pH至5.8。最后培养基中加9g的琼脂和30g蔗糖，在121℃高压灭菌20min，备用。在配制母液时，把Ca2+与SO42-、Ca2+与PO43-放在不同的母液中，以免发生沉淀。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。

1.2.2 外植体消毒取当年萌生的华肖菝葜带芽茎段，剪去残伤及叶片，先用软毛刷蘸洗衣粉水轻刷干净，然后用流水冲洗30min后，再用无菌水冲洗3次。在超净工作台上用70%的酒精浸泡15s，用20%的次氯酸钠溶液消毒，采用5个不同的时间分别处理5、10、15、20、25min。消毒好的外植体用无菌水冲洗5次，用消毒滤纸吸干水分，备用。在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。

1.2.3 启动培养消毒好的外植体用无菌水冲洗5次，用消毒滤纸吸干水分，接种到芽诱导培养基（A0-A12）上。培养基A0～A12植物生长调节剂为6-BA、NAA，如表1所示。30d后统计萌芽数量，计算诱导率。

2 结果与分析

2.1 外植体最佳消毒时间的确定灭菌剂的要求是灭菌效果好，从植物组织上清除容易，对人体无害，无环境污染。70%～75%的酒精是最常见的表面灭菌剂，具有较强的穿透力和灭菌作用，但对植物材料的杀伤作用也很大。氯化汞的灭菌效果极佳，但缺点是易在植物材料上残留，对环境危害大，对人有毒害。次氯酸钠是一种较好的灭菌剂，灭菌能力强，不易残留，对环境无害。在多次预试验中用次氯酸钠对外植体消毒，其效果较好。因此，实验采用次氯酸钠对华肖菝葜带芽茎段消毒。由表2可以看出，用20%次氯酸钠对华肖菝葜带芽茎段消毒，在处理25min时，材料的污染率最低，效果最好，因此确定外植体的最佳消毒时间为20min。

3 讨论

在本次试验中出现了褐化现象，这主要是在初期培养中，基本培养基上中高浓度的盐可以促进外植体内酚类物质的大量分泌，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。试验发现，当6-BA添加量减少时，褐化率明显降低，这主要是因为6-BA能促进酚类化合物的合成，并具有刺激多酚氧化酶活性的作用[12-13]，从而促进了外植体的褐化程度。在培养基中加入活性炭之后褐化的外植体明显减少，因为活性炭表面积大，可以吸附非极性物质及色素大分子，减少一些有害物质的影响。华肖菝葜在到目前为止所用过的培养基中，没有看到一般愈伤组织的形成，这是因为其形成的各种微小的愈伤组织随着根系的进一步分化逐渐消失[14]，因此也就没有像其他植物那样建立起茎、根等营养体接种到培养基上形成愈伤组织后再分化的系统。

参考文献

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[2]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草第8册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：106.

[3]明·李时珍.本草纲目[M].北京：人民卫生出版社，1979：1292.

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[5]Chen C T，Chang S M.Studies in nature products（7）.A study on the constituentsof Heterosmilax japonicakunth.Bull Inst Chem，1976，23：9.

[6]Zhang S J，Pan J G，Ji L，el al.Analysis of the volatile components in bai tu ling.[J].China J Chin Mater Med，1999，24（12）：740-741.

[7]秦文杰.短柱肖菝葜化学成分及质量控制研究[D].北京：北京中医药大学，2007.

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[11]刘永提，黄皎名.托柄菝莫组织培养技术研究[J].林业科技开发，2006（03）：45-48.