益气养阴方对2型糖尿病大鼠肝脏糖代谢紊乱的调节作用

刘碧原　赵静　刘进娜　谢鸣



益气养阴方对2型糖尿病大鼠肝脏糖代谢紊乱的调节作用

刘碧原赵静刘进娜谢鸣

目的探查益气养阴方对气阴两虚2型糖尿病型大鼠肝脏糖代谢紊乱的调节机制。 方法雄性SD大鼠随机分为正常组10只和造模组45 只。其中正常组给予基础饲料喂养；模型组给予高脂高糖饲料喂养。第6周，造模组大鼠给予一次性腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素，并于实验第6周末，选择空腹血糖≥11.1mmol/L的造模组大鼠随机分为模型组、中药组、西药组，每组10只；中药组给予益气养阴方[4.80 g/(kg·d)]，西药组给予盐酸吡格列酮[1.35 g/(kg·d)]，正常组和模型组分别以等量蒸馏水灌胃，连续给药两周。给药后，检测2型糖尿病气阴两虚证、肝脏胰岛素抵抗、肝脏糖代谢相关指标。 结果与正常组相比，模型组大鼠血中血糖(fasting plasma glucose，FPG)、血清胰岛素(fasting serum insulin，Fins)、胰岛素抵抗指数(insulin resistance index，IRI)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)、肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthasc kinase-3，GSK-3)均明显升高(P<0.01)；大鼠血中环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)、cAMP/cGMP和红细胞膜Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)，肝脏胰岛素受体(Insulin receptor，InsR)和胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate，IRS-2)、肝糖原含量均明显下降(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比，中药组和西药组大鼠FPG、IRI、肝脏PEPCK、GSK-3明显降低(P<0.05或P<0.01)，并且中药组血中Fins、cGMP、G-6-P下降，cAMP、cAMP/cGMP、红细胞膜Na+-K+-ATPase、IRS-1和肝糖原含量均明显上升(P<0.05或P<0.01)。与西药组相比，中药组大鼠血中cGMP降低，cAMP、cAMP/cGMP和红细胞膜Na+-K+-ATPase均升高(P<0.01)。 结论益气养阴方对2型糖尿病气阴两虚证大鼠的肝脏糖代谢有改善作用，其机制与胰岛素受体和糖代谢相关酶的调节有关。

益气养阴方；2型糖尿病；肝脏；糖代谢

“方证相关”是方剂学中的重要原理，方剂的功效或作用与其所作用对象密切相关[1]，因此在中医方剂的药理探查中，应充分考虑到其适宜病证模型的选择。前期的研究曾发现，采用高脂高糖喂养联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)注射复制的2型糖尿病大鼠模型在早期表现为中医气阴两虚证[2]，中医益气养阴方对该模型具有一定防治作用[3-4]。2型糖尿病的主要病理生理基础是胰岛素抵抗(insulin resrstamce,IR)，并贯穿疾病始终，其中肝脏作为胰岛素抵抗的主要靶器官之一，在胰岛素抵抗中了发挥重要作用[5]。本文基于“方证相关”的理论，选择2型糖尿病气阴两虚证大鼠模型，进一步探查益气养阴方对该模型大鼠肝脏糖代谢紊乱的调节作用。

1　材料和方法

1.1实验动物

选取SPF级健康雄性SD大鼠55只，体质量(190±10)g，动物许可证号为：SCXK(京)2011-0004，由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供。所有动物提前1周购入，6只/笼。光照节律,室温及湿度正常，并保持安静。

普通饲料许可证号：SCXK(京)2009-0012(生产批号：13103212)；高脂高糖饲料由2%胆固醇、0.5%牛胆酸钠、10%猪油、5%蔗糖、5%蛋黄粉、77.5%基础饲料复合而成，等级：A级，许可证号：SCXK(京)2014-0010。以上饲料均由北京科澳协力饲料有限公司加工提供。

1.2实验药物

益气养阴方及其颗粒制备：处方由黄芪15 g、生地黄12 g、山药10 g、山茱萸10 g、麦冬10 g组成。方中山药打成细粉，余药加水浸泡2小时，煎煮提取3次，每次1小时，加水量分别为10倍、8倍、8倍，滤过；合并3次滤液，减压浓缩(温度≤70℃)，干燥(温度≤70℃)，得干膏(出膏率为65.76%)；加入山药粉，混匀，加95%乙醇制成软材，14目筛制粒，干燥(温度≤70℃)，12目筛整粒，得干颗粒(1.578 g生药/g颗粒)。制剂制备在北京中医药大学中试车间完成。

西药盐酸吡格列酮片(15 mg×7/板/盒，日本武田药品工业株式会社生产，天津武田药品有限公司分装，生产批号：130406)。

1.3实验试剂和仪器

链脲佐菌素(批号：WXBB2432V)，购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；柠檬酸三钠(批号：1307202、1303262)，购自西陇化工股份有限公司；大鼠环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)酶联免疫试剂盒(批号：20150420.60320R)、大鼠环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)酶联免疫试剂盒(批号：20150420.60161R)、超微量Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)测定试剂盒(批号：20150115.40041R)、大鼠肝脏胰岛素受体(insulin receptor，InsR)数量酶联免疫试剂盒(批号：20150422)、大鼠胰岛素受体底物1(IRS-1)酶联免疫试剂盒(批号：20150920.60386R)、IRS-2酶联免疫试剂盒(批号：20150928. 60387R)、大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)酶联免疫试剂盒(批号：20150920.60435R)、大鼠葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)酶联免疫试剂盒(批号：20150420.60328R)、大鼠肝糖原酶联免疫试剂盒(批号：20150420.60354R)、大鼠糖原合成酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3，GSK-3)酶联免疫试剂盒(批号：20150420.60366R)，均由北京瑞格博科技发展有限公司提供。血糖试纸：Ultra稳豪(批号：3569812)，购自强生(中国)医疗器材有限公司。

釆血针(注式soft2型，批号：01-121276)，购自苏州施莱医疗器械有限公司；血糖仪(Ultra Easy型，批号：R1288052X)，购自强生(中国)医疗器材有限公司；电子天平(PL6001-S型)，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；离心机(Sigma3K30型)，购自Sigma公司；生化仪(UniCel DxC 600 Synchron型)，购自Beckman Coulter公司；酶标仪(Thermo Multiskan MK3型)，购自Thermo Scientific芬兰雷勃公司。

1.4试剂制备

0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液：称取2.1 g柠檬酸，溶于100 mL去离子水中，配成0.1 mol/L柠檬酸溶液A；称取2.94 g柠檬酸三钠，溶于100 mL去离子水中，配成0.1 mol/L柠檬酸三钠溶液B；按A液∶B液=1∶1.2比例混合配成柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，高温高压灭菌15分钟，4℃冷藏备用。

STZ溶液：称取一定量的STZ，用0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液配制成1%的浓度，调pH值至4.20，避光在冰浴中操作。

1.5造模方法

参照文献[6]，给予造模大鼠高脂高糖饲料，连续5周。第6周时，造模组大鼠给予一次性腹腔注射30 mg/kg STZ，正常组注射同剂量0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，注射第三天，尾静脉釆血检测大鼠空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L为成模标准。

1.6给药方法

大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组10只和造模组45只。其中正常组大鼠给予基础饲料喂养，造模组按上述方法造模，剔除空腹血糖<11.1 mmol/L的大鼠，将符合模型标准的大鼠继续给予高脂高糖饲料喂养至实验第8周末。于实验第6周末开始，将造模组成模大鼠随机分为模型组、中药组、西药组，共3组，每组10只，其中中药组和西药组分别予以益气养阴方，浓度为4.80 g/(kg·d)和盐酸吡格列酮，浓度为1.35 g/(kg·d)灌胃，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，连续给药两周。于第8周末，大鼠禁食12小时后，乙醚麻醉，腹主动脉采血，抗凝管中的全血立即用Na+-K+-ATP酶试剂盒进行检测；非抗凝管中血样于室温静置1小时后，3000 rpm离心15分钟，取血清；新鲜肝脏组织液氮迅速冷冻后，放入-80℃冰箱中保存待测。

1.7观测指标

(1)病证模型：血糖(fasting plasma glucose，FPG)，试纸测定；(2)血清胰岛素(fasting serum insulin，Fins)、cAMP、cGMP，ELISA法；(3)红细胞膜Na+-K+-ATPase，生化法；(4)胰岛素抵抗指数(IRI)：IRI=FPG*Fins/22.5；(5)胰岛素受体及底物：肝脏InsR、IRS-1、IRS-2，ELISA法；(5)肝糖代谢：PEPCK、G-6-P、GSK-3、糖原，ELISA法。

1.8统计学处理

2　结果

2.1益气养阴方对模型病证关联指标的影响

与正常组相比，模型组大鼠FPG、Fins及IRI均明显升高(P<0.01)。与模型组相比，中药组和西药组大鼠FPG、IRI均明显下降(P<0.05、P<0.01)；并且中药组Fins下降明显(P<0.01)。见表1。

表1　益气养阴方对模型大鼠2型糖尿病相关指标的影响±s)

注： 与正常组比较，aP<0.01； 与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05。

与正常组相比，模型组大鼠血中cAMP下降，cGMP升高，cAMP/cGMP和红细胞膜Na+-K+-ATPase均明显下降(P<0.01)。与模型组相比，中药组大鼠血中cAMP升高，cGMP降低，cAMP/cGMP、红细胞膜Na+-K+-ATPase均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；西药组cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、Na+-K+-ATPase均未见明显差异。与中药组相比，西药组大鼠血中cAMP下降、cGMP升高、cAMP/cGMP和红细胞膜Na+-K+-ATPase均降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2　益气养阴方对模型大鼠气阴两虚证相关指标的影响±s)

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与中药组比较，cP<0.01。

表3　益气养阴方对模型大鼠肝脏胰岛素受体关联指标的影响±s)

注： 与正常组比较，aP<0.01，bP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表4　益气养阴方对模型大鼠肝脏糖代谢相关指标的影响±s)

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05；剔除了离散度较大的数据，故每组只有8只。

2.2益气养阴方对模型大鼠肝脏胰岛素受体相关指标的影响

与正常组相比，模型大鼠肝脏InsR和IRS-2均明显减少，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)；IRS-1未见明显变化(P>0.05)。与模型组相比，中药组和西药组大鼠的InsR和IRS-2均呈不同程度的增加，但差异均无统计学意义(P>0.05)；中药组IRS-1有所增加(P<0.05)；与中药组相比，西药组大鼠的InsR、IRS-1和IRS-2水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.3益气养阴方对模型大鼠肝脏糖代谢相关指标的影响

与正常组相比，模型组大鼠肝脏PEPCK、G-6-P、GSK-3均升高，肝糖原降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，中药组和西药组大鼠肝脏PEPCK、GSK-3均见降低，中药组G-6-P降低、糖原升高(P<0.05、P<0.01)；与中药组相比，西药组大鼠肝脏PEPCK、G-6-P、GSK-3及糖原水平未见明显差异(P>0.05)。见表4。

3　讨论

2型糖尿病是一种多基因遗传、环境因素综合作用的内分泌代谢疾病，其确切的病因和发病机制尚未完全明了，临床表现常以多饮、多食、多尿、高血糖及高胰岛素血症为主要特征，胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发病的两个重要病理环节[7]。

气阴两虚证是2型糖尿病中医临床辨证的重要证型之一[8]，研究提示中医阴阳失调主要表现在cAMP/cGMP比值的变化[9]，2型糖尿病阴虚内热证模型大鼠 cAMP/cGMP比值明显升高[10]，临床2型糖尿病气阴两虚证患者红细胞膜Na+-K+-ATP酶含量降低[11]和血浆cAMP 的升高[12]，提示cAMP/cGMP和Na+-K+-ATP酶的异常是2型糖尿病气阴两虚证的重要指标。本实验再次观察到该模型大鼠不仅出现血糖、血清胰岛素及IR指数的明显升高，而且还伴有血中cAMP/cGMP和红细胞膜Na+-K+-ATP酶含量的减低，结合之前观察到的该模型大鼠出现食量、饮水量及尿量增多、体重减轻、少动及抓握力减低等外观表征[13]，判断该模型是一个2型糖尿病中医气阴两虚证模型。实验中的益气养阴方可以明显降低模型大鼠血糖、血清胰岛素水平，并能升高血中cAMP/cGMP比值及红细胞膜Na+-K+-ATP酶的含量，显示其对2型糖尿病气阴两虚证的综合治疗作用。

IR是指组织对胰岛素的敏感性下降，表现为胰岛素所介导的相关生物学功能的异常。IRS作为一种船坞蛋白，为胰岛素的信号转导蛋白提供了高亲和力的结合位点，是胰岛素发挥作用的重要环节。其中IRS-1在脂肪、肝脏、骨骼肌等均有分布，IRS-2则主要在肝脏中表达[14]。肝脏在胰岛素抵抗状态下，胰岛素受体与IRS-1/2的数量减少，结合能力下降， IRS下游的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)磷酸化水平减低，胰岛素信号经PI3K通路转导减弱，进而引起肝脏糖代谢紊乱而致血糖升高[15]。

肝脏糖原异生和糖原合成/分解是维持机体血糖水平的两个主要代谢途径，其中一些关键限速酶发挥了重要的调节作用。GSK-3通过使糖原合成酶磷酸化而抑制其活性，使糖原合成减少；PEPCK是肝糖异生的限速酶，其活性升高使糖异生增强；G-6-P则是糖原分解和糖异生最后一步反应的酶，其活性升高可使肝脏糖异生增强和葡萄糖输出增加。肝脏糖原合成减少和糖异生增强被认为是导致2型糖尿病血糖升高的主因[16]。研究发现，2型糖尿病模型大鼠肝脏GSK-3增多[17]，PEPCK和G-6-P的mRNA的表达增加[18]。

本次实验结果显示，该模型大鼠血糖和胰岛素水平升高，肝脏胰岛素受体数量及IRS-2水平下降，同时肝脏糖原含量减少，且伴有GSK-3、PEPCK和G-6-P水平的明显升高，表明该模型大鼠的肝脏出现胰岛素抵抗和糖代谢调节紊乱。益气养阴方能降低肝脏GSK-3、PEPCK和G-6-P水平，并增加肝脏糖原的合成，表明其对肝脏糖代谢中关键酶具有调节作用。同时，实验中模型大鼠肝脏胰岛素受体数量及IRS-2明显减少，而中药和西药两组对其仅显示升高作用趋势，其中中药组对大鼠肝脏IRS-1却有明显升高作用，提示西药的干预效应与其胰岛素受体作用关系不大，而益气养阴方则可能通过增加胰岛素受体及IRS-1的水平及调节糖代谢关键酶等多种途径，改善胰岛素抵抗而发挥其防治作用。

益气养阴方对于2型糖尿病模型中医气阴两虚证具有显著的治疗作用，较之于西药吡格列酮，其对于血糖、血清胰岛素及胰岛素抵抗指数、血中cAMP/cGMP和红细胞膜Na+-K+-ATPase酶等指标具有更明显的改善作用，提示其在治疗2型糖尿病气阴两虚证方面具有某种优势。上述结果为中医辨证(因证选方)防治2型糖尿病的经验提供了一定的实验证据。

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(本文编辑： 韩虹娟)

Effects ofYiqiYangyinformula on hepatic glucose metabolism disorder in type2 diabetes rat

LIUBi-yuan，ZHAOJing，LIUJin-na，etal.

FormularyDepartment,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029，China

XIEMing，E-mail：xieming603@263.net

ObjectiveTo discuss the mechanism ofYiqiYangyinformula on regulating the disorder of liver glucose metabolism in type2 diabetes model rats. MethodsHealthy male SD rats were randomly divided into normal group(group 1, 10 rats) and model group(45 rats). The normal group were given basic diet; the model group was given high-fat and high-sugar diet. At the 6th week of experiment, the model group were intraperitoneal injection with 30 mg/kg STZ, and then randomly divided into model group (group 2), TCM group(group 3) and western medicine group(group 4), 10 rats in each group. Group 3 were given theYiqiYangyinformula[4.80 g/(kg·d)], and group 4 were given pioglitazone hydrochloride [1.35 g/(kg·d)], the normal group and model group were given the same amount of distilled water, the treatment was lasted for two weeks. The indicators associated with the deficiency of both qi and yin, hepatic insulin resistance and liver glucose metabolism on type 2 diabetes wer observed. ResultsCompared with group 1, FPG, Fins, IRI, blood cGMP, liver PEPCK, G-6-P, GSK-3 of group 2 were significantly increased (P<0.01); the cAMP, cAMP/cGMP and Na+-K+-ATPase in blood, the liver InsR，IRS-2 and glycogen content was significantly decreased (P<0.05,P<0.01). Compared with the group 2, the FPG, IRI in blood and PEPCK, GSK-3 in liver of group 3 and group 4 were significantly decreased (P<0.05 orP<0.01); the Fins, cGMP in blood and G-6-P in liver of group 3 was decreased，but the level of cAMP , cAMP / cGMP and Na+-K+-ATPase in blood, IRS-1, glycogen in liver were significantly increased (P<0.05,P<0.01); Compared with group 4, the cGMP was decreased, but the cAMP, cAMP/cGMP and Na+-K+-ATPase were increased (P<0.05,P<0.01) of the group3.ConclusionTheYiqiYangyinformula can regulate the disorder of liver glucose metabolism in type 2 diabetes model rats，the mechanism is to regulate both the insulin receptors and the enzymes related to glucose metabolism.

YiqiYangyinformula；Type2 diabetes；Liver；Glucose metabolism

国家自然科学基金(81373541)

100029北京中医药大学基础医学院方剂教研室

刘碧原(1990- )，2014级在读硕士研究生。研究方向：方证相关及其生物学基础的研究。E-mail：bucmyuan@foxmail.com

谢鸣(1956- )，博士，教授。研究方向：方证相关的研究。 E-mail：xieming603@263.net

R254.23

Adoi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.10.006

2016-04-09)