低分子肝素对高脂血症性胰腺炎大鼠VEGF表达的影响

陈　伟，姜　琦，李　健，周国雄*

（1.南通大学附属东台医院，江苏盐城224200；2.南通大学附属医院，江苏南通226001）

低分子肝素对高脂血症性胰腺炎大鼠VEGF表达的影响

陈伟1，姜琦1，李健1，周国雄2*

（1.南通大学附属东台医院，江苏盐城224200；2.南通大学附属医院，江苏南通226001）

目的研究低分子肝素对大鼠高脂血症性胰腺炎胰腺微循环的作用机制。方法将72只健康SD大鼠随机分成假手术组、模型组和治疗组各24只，每组再随机分成四个亚组。先采用高脂饮食建立高脂血症模型，模型组和治疗组制作大鼠急性胰腺炎模型，制模成功后治疗组分别于0、6、12、18 h开始使用低分子肝素皮下注射，各亚组均间隔6 h重复皮下注射一次，每亚组均干预4次；模型组和假手术组同时间点皮下注射等量生理盐水对照。结果大鼠胰腺血流速度模型组低于假手术组，治疗组高于模型组（P＜0.05）；胰腺组织病理学评分模型组高于假手术组，治疗组低于模型组（P＜0.05）；模型组各亚组胰腺血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达、VEGF mRNA表达水平均高于假手术组，而治疗组均低于模型组（P＜0.05）。结论大鼠高脂血症性胰腺炎，VEGF与微循环障碍密切相关；低分子肝素可能通过下调胰腺组织VEGF水平来改善胰腺微循环障碍，减轻胰腺组织进一步损害，且早期干预价值更大。

高脂血症性胰腺炎；低分子肝素；血管内皮细胞生长因子；微循环障碍；大鼠

〔Abstract〕Objective To study the action mechanism of low molecular weight heparin on pancreatic microcirculation of rats with hyperlipidemic pancreatitis.M ethods 72 healthy SD rats were random ly divided into sham operation group，model group and treatment group with 24 rats in each group.Then each group was random ly divided into four subgroups.The rats were first used the high fat diet to establish hyperlipidemia model，the model group and treatment group was to make acute pancreatitis rat models，after the model success，the treatment group were given low molecular heparin subcutaneous injection at 0，6，12 and 18 h，the subgroups were repeated the rejection per 6 hours for four times per；model group and sham operation group were injected with equivalent saline at the same time.Results The pancreatic blood flow velocity in model group was lower than that in the sham operation group，the treatment group was higher than that in the model group（P＜0.05）.The pathological score in the model group was higher than that in sham operation group，the treatment group was lower than that in model group（P＜0.05）.The expression of VEGF protein and mRNA VEGF expression in the model group were significantly higher than those in the sham operation group，the treament group was lower than that in the model group（P＜0.05）. Conclusion VEGF is closely related to the disturbance of microcirculation in rats with hyperlipidemia.The low molecular weight heparin may down regulate the VEGF level of pancreatic tissue to improve the pancreatic microcirculation disturbance，and reduce the damage of pancreatic tissue，and the value of early intervention is greater.

〔Keywords〕hyperlipidemia pancreatitis；low molecular weight heparin；vascular endothelial growth factor；microcirculation disturbance；rats

近年来高脂血症性胰腺炎（hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP）的发病率逐年升高［1］。新近研究表明微循环障碍是重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）的启动因子和持续损伤因子［2］，目前研究发现低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）除了抗凝、抗血小板聚集作用外，还有抗炎、调节细胞凋亡、调节脂代谢等作用［3］。王湘英等［4］研究发现LMWH可能通过抑制PAF、ET-1/NO浓度发挥抗血栓作用，从而改善胰腺微循环，降低胰腺病理损害，且早期干预较晚期干预效果更好。也有研究发现，肝素可通过降低SAP血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平从而减轻胰腺损害［5］。本研究通过制作大鼠HLAP模型，观察胰腺病理学、胰腺血流速度及血清VEGF、胰腺VEGF变化，LMWH对其的影响，旨在探讨LMWH对改善HLAP大鼠胰腺微循环障碍的可能的其他机制。

1　材料

1.1动物

健康SD大鼠72只，雄性，清洁级，体质量（250±20）g，由南通大学（医学院）动物实验中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2008-0010。

1.2饲养条件

动物饲养在SPF级屏障环境内，昼夜明暗交替时间：12 h/12 h。高脂饲料喂养，饮水为自来水瓶装后高压灭菌。动物自由采食和饮水；每周换两次经高压灭菌的松木刨花垫料。饲养室内每周用0.5%新洁尔灭水溶液喷雾消毒一次。实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2012-0031。

1.3主要仪器

（1）全自动生化分析仪（日立7600）；（2）J417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；（3）Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR仪（德国Eppendorf公司）；（4）电子天平（ML204/02，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；（5）Step One Real-Time PCR System（美国ABI公司）；（6）Preflux 4001双通道激光多普勒血流仪（瑞典Perimed公司）。

1.4主要试剂

（1）牛磺胆酸钠（Sigma公司）；（2）水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司）；（3）低分子肝素钠（希弗全，意大利阿尔法韦士曼制药公司）；（4）大鼠VEGF ELISA试剂（上海依科赛生物制品有限公司）；（5）VEGF免疫组化试剂盒（ABCAM公司）。

2　方法

2.1造模方法

按随机数字表法分为3组：治疗组、模型组、假手术组，每组各24只。每组再按开始干预时间点（0、6、12、18 h）随机分成4个亚组，每亚组6只。3组大鼠以高脂饲料（88%的基础饲料+10%猪油+2%胆固醇）喂养4周，大鼠在高脂饲料喂养前后均抽血化验甘油三脂浓度，以喂养后血清甘油三酯浓度超过喂养前三倍以上说明高脂血症大鼠模型造模成功。治疗组和模型组采用5%牛磺胆酸钠（购自Sigma公司）逆行胰胆管注射方法制备AP模型。假手术组仅在手术中轻轻翻动十二指肠。模型制作成功后，治疗组大鼠按事先分好的亚组在右侧腹壁皮下注射LMWH 0.2 ml/100 g/次（100 IU/kg/次），每6 h重复皮下注射一次，每个亚组共干预4次，在最后一次干预后6 h再次麻醉开腹取标本。模型组和假手术组均以等量的生理盐水同样方法、同样时间点做对照干预。成模后各组大鼠均禁食、禁饮，常规补充生理盐水（背部皮下注射生理盐水一次2 ml/100 g，每6 h重复补液一次，直到各组大鼠试验结束）。

2.2指标检测

在实验结束后，再次麻醉开腹，用多普勒血流仪测定胰腺血管血流速度，首先在胰头和胰尾处，然后在胰体部选取和胰头、尾等距的两点测定，测定时避开大血管或血肿，最后取平均值作为结果；门静脉取血，采用全自动生化分析仪检测血清甘油三酯（Triglyceride，TG）浓度及淀粉酶；取大鼠胰腺组织放入中性甲醛固定液中，用于病理观察，参照改良Schmidt评分标准［6］对胰腺组织损伤进行定量评分；应用免疫组化方法检测胰腺组织VEGF，其阳性判断采用光镜高倍（×400）下观察，每视野选取100细胞，连续观察5个视野，根据胞浆或胞核染色深浅分为4个等级（0～3），求5个视野的平均值，作为一张切片的染色得分；RT-PCR检测胰腺组织VEGF mRNA表达。

2.3统计学方法

实验计量数据分析采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量数据用“±s”表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1血清TG及淀粉酶的变化

喂养前三组大鼠TG水平比较无统计学差异（P＞0.05）；各组喂养后TG水平均较喂养前升高三倍以上，提示高脂血症模型制备成功。模型组血清淀粉酶与治疗组比较无统计学差异（P＞0.05），而模型组、治疗组均高于假手术组三倍以上，提示急性胰腺炎大鼠模型制备成功（表1）。

表1　各组大鼠血清TG、淀粉酶变化（±s）

表1　各组大鼠血清TG、淀粉酶变化（±s）

注：与假手术组喂养前比较，△P＜0.01；与各组喂养前比较，#P＜0.01。

分组n TG（mmol/L）喂养前喂养后假手术组模型组治疗组24 24 24 0.680±0.057 2.487±0.272#0.660±0.102 2.338±0.399#0.648±0.087 2.346±0.353#淀粉酶（u/dL）1730.6±301.9 6213.8±451.8△5339.8±421.4△

3.2胰腺微循环血流速度变化

模型组与假手术组各对应亚组比较胰腺血管血流速度明显下降（P＜0.01）；治疗组与假手术组各对应亚组比较胰腺血管血流速度明显上升（P＜0.01）（表2）。

表2　胰腺血管血流速度比较（±s，n=6）

表2　胰腺血管血流速度比较（±s，n=6）

注：与同时段假手术组比较，*P＜0.01；与同时段模型组比较△P＜0.01。

0 h 6 h 12 h 18 h组别假手术组模型组治疗组100.2±7.8 98.4±8.5 101.7±8.4 99.7±9.2 90.2±5.3*88.4±4.7*84.7±5.5*86.4±4.9* 149.2±6.9△133.1±8.0△117.6±8.1△106.2±6.5△

3.3胰腺组织病理学改变

假手术组胰腺组织无明显改变。模型组胰腺腺泡小叶水肿，可见大量炎症细胞浸润，点状出血坏死，胰腺血管内可见大量血栓形成，可见较少正常血管管腔。治疗组胰腺腺泡小叶水肿，可见大量炎症细胞浸润，点状出血坏死，胰腺血管内可见少量血栓形成，可见较多正常血管管腔，较模型组病理损伤明显减轻，病理评分明显降低（表3）。

3.4胰腺组织VEGF蛋白表达的变化

假手术组胰腺组织中VEGF蛋白较少表达，胰腺炎成模后胰腺组织中VEGF蛋白明显表达，经LMWH干预后治疗组胰腺组织VEGF蛋白表达评分低于模型组，且随着开始干预时间点推移两者差异逐渐变小（表4，图1～4）。

表3　各组胰腺HE染色评分比较（±s，n=6）

表3　各组胰腺HE染色评分比较（±s，n=6）

注：与同时段假手术组比较，*P＜0.05；与同时段模型组比较，△P＜0.01。

组别0 h 6 h 12 h 18 h假手术组模型组治疗组0.45±0.51 0.49±0.52 0.50±0.48 0.53±0.51 10.88±0.69*12.31±0.75*12.75±0.73*12.50±0.64* 5.26±0.61*△5.91±0.58*△8.42±0.59*△8.72±0.55*△

表4　胰腺VEGF免疫组化评分比较（±s，n=6）

表4　胰腺VEGF免疫组化评分比较（±s，n=6）

注：与同时段假手术组比较，*P＜0.05；与同时段模型组比较，△P＜0.05。

组别0 h 6 h 12 h 18 h假手术组模型组治疗组29.7±5.2 30.2±4.5 31.9±4.7 31.1±5.3 198.4±30.4*232.1±32.2*265.1±31.5*296.5±30.7* 136.2±27.6*△162.7±35.6*△252.1±30.1*284.9±32.8*

图1　0 h亚组胰腺VEGF免疫组化图片（×400）

图2　6 h亚组胰腺VEGF免疫组化图片（×400）

图3　12 h亚组胰腺VEGF免疫组化图片（×400）

图4　18 h亚组胰腺VEGF免疫组化图片（×400）

3.5RT-PCR检测胰腺组织VEGF mRNA表达

治疗组及模型组中的VEGF mRNA表达水平均高于假手术组对应亚组（P＜0.01）（表5）。

4　讨论

VEGF属于一种糖蛋白，其主要作用是促进血管的生长，提高血管通透性，广泛存在于机体的各个组织中，是目前认识的直接作用于机体内皮细胞最强的细胞生长因子［7］。在急性胰腺炎情况下，体内VEGF都保持较高水平，在胰腺组织中也出现VEGF高水平表达，且在急性坏死性胰腺炎升高明显，VEGF水平的升高可能预示胰腺炎患者的微循环障碍出现了加重的趋势［8］。VEGF也能够调控中性粒细胞的附壁和浸润，增加血管内皮的通透性［9］。

肝素作为一种抗凝药物在临床已广泛应用，目前临床应用的肝素制剂有两种：普通肝素和低分子肝素（LMWH）。LMWH与普通肝素相比具有抗血栓形成能力强、出血危险性小、半衰期短等优点［10］；能和血管内皮细胞结合，具有保护血管内皮细胞，维持内皮细胞的完整，促使内皮细胞释放组织纤溶酶原激活物，抑制血栓素的活化，发挥纤溶和抗血栓作用［11］；近年来有研究发现低分子肝素还可能通过抑制NF-kB的活性，从而诱导胰腺腺泡细胞凋亡，减轻胰腺炎症程度［12］。低分子肝素还可能通过抑制HIF-1α，VEGF和TGF-β1改善腹膜功能和抑制腹膜纤维化［13］。

表5　VEGF mRNA在胰腺组织中表达水平（±s，n=6）

表5　VEGF mRNA在胰腺组织中表达水平（±s，n=6）

注：与同时段假手术组比较，*P＜0.05；与同时段模型组比较，##P＜0.01。治疗组相邻各亚组两两比较，△P＜0.05。

0 h 6 h 12 h 18 h组别假手术组模型组治疗组0.96±0.12 1.04±0.08 0.97±0.12 1.02±0.07 8.67±1.28*9.32±1.21*10.41±1.33*9.29±1.11* 4.89±1.77*#5.77±1.21*##6.52±1.12*##8.27±1.35*△

本实验通过对HLAP大鼠采用LMWH进行不同时间点（0、6、12、18 h）皮下注射干预和生理盐水同样的方法皮下注射对照比较。结果说明：（1）LMWH可以改善HLAP大鼠模型的胰腺微循环障碍，减轻胰腺坏死程度及微血管内血栓形成，经过LMWH干预后大鼠血清VEGF、胰腺组织VEGF及VEGF mRNA表达水平与同时间点对照组均有所下调，我们推论LMWH可能通过下调胰腺组织VEGF水平来改善胰腺微循环障碍，减轻胰腺组织进一步损害。（2）LMWH早期应用（6～12 h）对降低VEGF水平改善胰腺微循环障碍意义更大。

综上所述，大鼠高脂血症性胰腺炎时，VEGF与微循环障碍密切相关；低分子肝素可能通过下调胰腺组织VEGF水平来改善胰腺微循环障碍，减轻胰腺组织进一步损害，且早期干预价值更大。

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（本文编辑 李杰）

Effect of Low M olecular Weight Heparin on the Expression of VEGF in Rats w ith Hyperlipidem ic Pancreatitis

CHEN Wei1，JIANG Qi1，LI Jian1，ZHOU Guoxiong2*
（1.Affiliated Dongtai Hospital of Nantong Medical Uniwersity，Yancheng，Tiangsu 224200，China；2.Affiliated Hospital of Nantong Medical Uniwersity，Nantong，Jiangsu 226001，China）

R587

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.05.006

2015-10-20

江苏省盐城市医学科技发展项目（YK20130106）。

陈伟，男，主治医师，硕士研究生，研究方向：消化内科疾病的防治。

*周国雄，男，教授，博士研究生导师，E-mail：zhou.guoxiong@aliyun.com。