红芪多糖对糖尿病大鼠视网膜VEGF和Ets-1表达的影响*

张花治，刘　莹，李桂珍，金智生

(甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730000)



·实验研究·

红芪多糖对糖尿病大鼠视网膜VEGF和Ets-1表达的影响*

张花治，刘莹，李桂珍，金智生

(甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730000)

目的：观察红芪多糖(hedisari polysacchcaide，HPS)对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和E26转录因子-1(Ets-1)蛋白表达水平的影响，并探讨其机制。方法：用60 μg/g一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型。将糖尿病模型大鼠分为模型对照组、多贝斯组[90 mg/(kg·d)]和HPS高(200 μg/g)、中(100 μg/g )、低剂量(50 μg/g)组，另设正常对照组，每组10只。均灌胃给药，1 d 1次，药物组给予相应药物，模型对照组和正常对照组给予等剂量生理盐水，连续8周。8周后采用免疫组织化学法和qRT-PCR方法检测Ets-1、VEGF的蛋白表达和mRNA相对表达量。结果：与正常对照组对比，模型对照组视网膜VEGF、Ets-1的蛋白表达增加(P<0.05)，视网膜VEGF和Ets-1 mRNA相对表达量明显升高(P<0.05)。与模型对照组对比，HPS高、中、低剂量组和多贝斯组的VEGF和Ets-1蛋白表达明显降低(P<0.05), VEGF和Ets-1 mRNA相对表达含量也明显降低(P<0.05)；HPS高剂量组最接近正常对照组。结论：HPS对DM大鼠视网膜有保护作用，推测其机制可能是通过降低视网膜中VEGF、Ets-1的含量来阻遏糖尿病性视网膜病变进程中新生血管生成与增殖，且HPS高剂量组的效果最好。

糖尿病大鼠模型；红芪多糖；血管内皮生长因子；E26转录因子-1；视网膜；动物；大鼠

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见、严重的并发症之一，是全世界20～60岁人群中致盲的首要原因[1-2]。近年来，许多学者认为DR主要病理过程为新生血管形成及增殖，而新生血管发生、发展与血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 和E26转录因子-1(Ets-1)有着密切的关系[3-4]。Ets-1在血管生成中起着重要的调控作用，可通过诱导VEGF的表达来调控血管发生过程，而VEGF可以反过来上调Ets-1的表达。这个正调控系统在血管发生中起了主要作用。前期研究[5-6]表明：红芪多糖(hedisari polysacchcaide，HPS)能显著改善糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型的相关指标，并保护胰腺和肾脏组织。本研究采用qRT-PCR法和免疫组化法进一步观察HPS对糖尿病大鼠视网膜VEGF及Ets-1表达的影响，探讨HPS阻遏DR进程中新生血管生成、增殖的可能性以及其作用机制。

1　材料与方法

1.1动物

雄性SPF级Wistar大鼠60只, 体质量180～220 g，购自甘肃中医学院SPF级实验动物中心，动物许可证号：SCXK(甘)2011-0001。

1.2药品、试剂与仪器

红芪多糖[7]由甘肃中医药大学药学院按照文献方法[8]制备，纯度 70%；多贝斯，西安利君制药有限责任公司产品，批号1305066-1。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma公司产品，批号S0130-1G； Ets-1鼠抗人多克隆抗体，Lab Vision公司产品，批号DS-2562-GO；兔抗人VEGF多克隆抗体，Abcam公司产品，批号 ab411545；DAB显色试剂盒(批号K145615B)和免疫组化试剂盒(批号13155A11)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；总 RNA提取试剂盒II，OMEGA公司产品，批号R6945 ；TIANScript cDNA第一链合成试剂盒(批号RT120430)、2×Taq PCR MasterMix(批号KT201-05)，为天根生化科技有限公司产品。稳豪倍优 One Touch血糖测定仪，美国强生Lifescan公司产品；OSE-Y10微量电动组织匀浆器，Tiangen 公司产品；CT14RD台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司产品；D1008型掌上离心机，美国 SCILOGEX 公司产品；Q5000型超微量紫外分析仪，美国 Quawell 公司产品；7500型RT-PCR 热循环仪，美国ABI公司产品。

1.3模型的建立、分组与给药

建模前对大鼠进行全身及眼部检查以排除原发性疾病。随机选取50只大鼠禁食12 h，一次性腹腔注射STZ(60 μg/g ，溶于新配制的0.1 mol/L、pH值4.5的柠檬酸钠缓冲液中)，72 h后尾静脉取血测血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L以上、尿量和饮水明显增多者为糖尿病模型诱导成功。另外10只腹腔注入等量柠檬酸钠缓冲液，72 h后测量空腹血糖均<5.6 mmol/L，设为正常对照组。将造模成功的50只大鼠采用随机数字表法分为模型对照组、多贝斯组和HPS高、中、低剂量组，每组10只。多贝斯组每日灌胃多贝斯 90 μg/g，HPS高、中、低剂量组分别灌胃HPS 200，100，50 μg/g，正常对照组、模型对照组灌胃等体积的生理盐水，1 d 1次，连续8周。各组大鼠均给标准饲料喂养，定期测血糖、体质量。

1.4检测指标

采用免疫组织化学法和qRT-PCR方法检测VEGF、Ets-1的蛋白表达和mRNA相对表达量。实验灌胃8周后，以质量分数100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，断颈处死，摘取眼球；右眼球去除眼前节，剥离视网膜组织，液氮速冻，置于EP管中，于-80 ℃冰箱中储存备用；左眼置于40 g/L多聚甲醛(4 ℃，24 h)固定。其中每组的5只眼球切除眼前节并剥离视网膜后再放入固定液中固定(用于检测VEGF)；另外5只眼球直接放入固定液中固定，48 h后将整个眼球的部分切除眼前节(用于检测Ets-1)，然后与剥离的视网膜一起进行梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡、包埋。最后将平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行3 μm厚连续切片，每只眼球选取10个面(去掉有视神经断面的切面)，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片，行免疫组织化学检测。

1.4.1VEGF和Ets-1蛋白表达的检测

提取视网膜总RNA及反转录反应 Trizol一步法提取总RNA。反转录反应体系：总RNA 3 μg，OligodT 1 μL，dNTP 1 μL，5×Buffer 4 μL，逆转录酶0.5 μL，加入经DEPC处理的无菌水至20 μL。反应条件：45 ℃反应1 h，95 ℃ 5 min终止反应。反应结束后，-20 ℃冰箱保存备用。qRT-PCR反应：从GenBank获得目的基因mRNA的全长序列，利用引物和探针设计软件Primer 5.0设计引物序列。经过Blast分析，引物序列具有特异性。以β-actin为内对照进行qPCR反应引物序列。β-actin：上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。VEGF：上游引物5′-CTGTACCTCCACCATGCCAAG-3′ ，下游引物5′-ACAAGGCTCACAGT-3′。Ets-1：上游引物5′-GGGGCCAGGACTCTTTTGAG-3′，下游引物5′-TTGAATTCCCAGCCGTCTCC-3′。反应体系：cDNA 1 μL，上游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，下游引物(20 pmol/μL)0.5 μL，2×SYBR Green 1 μL，2×mix 12.5 μL。加无菌水至25 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火温度30 s(β-actin 54 ℃、VEGF 55 ℃，Ets-1 55 ℃)，72 ℃延伸30 s，共40个循环。反应结束后，得到每份样品中VEGF进行PCR扩增时达到阈值时的Ct值。按目前通用的方法是2-△△CT计算各组间目标基因的表达量的差别，每个标本重复3次，取平均值为CT值。以模型组目标基因的表达量为1，2-△△CT值即为处理后目的基因表达较处理前的倍数。

1.4.2VEGF和Ets-1蛋白表达的免疫组化检测

按照兔抗人VEGF和鼠抗人Ets-1多克隆抗体免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒操作说明对切片进行免疫组织化学染色。每个组织块均取3 μm 厚的切片用于免疫组织化学染色，梯度酒精水化，体积分数30 mL/L的H2O2去离子水孵育，微波(95 ℃，3 min)抗原修复。正常山羊血清封闭，依次加入一抗、生物素化二抗，SP复合物，DAB显色，复染，脱水，透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察、拍照。各组大鼠随机选取4张切片，每张切片在400倍镜下随机采集阳性染色最强的5个视野，输入计算机后运用 Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件进行系统测定视网膜 VEGF和Ets-1的免疫组织化学染色阳性信号的光密度值，取平均值(平均光密度OD值)。

1.5统计学方法

2　结　果

2.1各组大鼠视网膜组织中VEGF和 Ets-1 mRNA相对表达含量对比

与正常对照组对比，模型对照组的VEGF和Ets-1 mRNA相对表达量升高，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，HPS各剂量组及多贝斯组的VEGF和Ets-1 mRNA相对表达量有不同程度降低，差别有统计学意义(P<0.05)，其中HPS高剂量组VEGF和Ets-1 mRNA表达接近正常对照组。见表1。

组 别剂量/(g·kg-1)VEGFmRNAEts-1mRNA正常对照组—0.2938±0.12*0.1471±0.09*模型对照组—11多贝斯组0.090.3499±0.18**0.2160±0.13*HPS低剂量组0.050.7067±0.08**##0.6109±0.12**##HPS中剂量组0.100.5856±0.11**#0.5278±0.15**#HPS高剂量组0.200.3825±0.14**0.2396±0.13*F值25.55339.919P值0.0000.000

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与HPS高剂量组对比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2各组大鼠视网膜组织中VEGF和Ets-1蛋白表达的平均光密度值对比

免疫组织化学结果中VEGF和Ets-1免疫阳性反应呈棕色，定位于胞浆内。正常对照组视网膜VEGF和Ets-1免疫阳性反应主要见于神经节细胞层及内丛状层细胞，内核层少有表达。HPS各治疗组、多贝斯组和模型对照组阳性反应增强，大鼠视网膜各层细胞的胞浆内均可见棕色的阳性颗粒，阳性部位主要位于神经节细胞层、内核层及内外丛状层。模型对照组与正常对照组对比，VEGF和Ets-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；多贝斯组，HPS高、中、低剂量组 VEGF蛋白表达水平明显低于模型对照组 (P<0.05)；HPS高剂量组与多贝斯组，HPS中、低剂量组对比，VEGF和Ets-1蛋白表达水平明显降低 (P<0.05)。见表2。

组 别剂量/(g·kg-1)VEGFEts-1正常对照组—9.31±3.60**0.61±0.10**模型对照组—17.24±4.206.84±1.20多贝斯对照组0.0912.35±8.24**#2.35±1.24**#HPS低剂量组0.0515.15±7.84*##3.15±1.84**##HPS中剂量组0.1013.45±4.25**#2.15±1.25**#HPS高剂量组0.2010.68±5.61**1.02±0.61**F值2.49738.048P值0.0420.000

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与HPS高剂量组对比，#P<0.05，##P<0.01。

3　讨　论

缺氧和高血糖可导致视网膜组织供血不足，机体会通过增加 VEGF 的表达，促进新生血管形成来改善供血、供氧不足；但新生血管的形成可加速DR病程发展[9]。VEGF 不仅能够促进血管内皮细胞的生长，还可以增加血管内皮细胞的通透性，使大量血浆蛋白溢出，进一步为新血管的生成提供良好的基质[10]。Caldwell[11]认为高血糖介导的氧化应激对VEGF的表达和活性的影响，导致一系列细胞和分子改变，最终促成了新生血管和增殖性糖尿病视网膜病变的形成；临床研究也证实DR患者的玻璃体液体中VEGF的含量明显上升，并且与视网膜新生血管化的进程一致[12]。Ets-1表达参与了血管发生和损伤修复过程，血管发生需要Ets-1的参与。体外实验证明在培养的人脐静脉内皮细胞中，VEGF可以诱导Ets-1表达，VEGF结合内皮细胞表面的受体，形成异源二聚体介导这一作用[13]。Ets-1在血管生成中起着重要的调控作用，可通过诱导VEGF的表达来调控血管发生过程，而VEGF可以反过来上调Ets-1的表达，这个正调控系统在血管发生中起了重要作用；因此，抑制VEGF及Ets-1的表达为目前治疗DR的靶方向。

研究显示：黄芪具有益气活血、养阴散瘀之功效，可以改善视网膜微循环，提高机体免疫力，抑制视网膜周细胞的凋亡[14]；而黄芪多糖具有调节免疫功能和抗氧化的作用，能减少自由基的生成，增加自由基的清除，还可明显地扩张血管，降低血黏度，促进血液循环，改善微循环，能够降低糖尿病大鼠早期视网膜Muller细胞Kir2.1蛋白表达下降，从而起到减少DR发病率的作用[15]。甘肃地道药材红芪是豆科植物多岩黄芪的干燥根，与黄芪同科异属，与黄芪性味、归经、功效、主治基本相同，药理作用相似。前期研究表明：HPS对糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型血糖、血脂、TNF-α、IL-6等指标均有改善作用，并可以保护胰腺和肾脏组织[5-6]。本研究进一步观察了HPS对糖尿病大鼠视网膜VEGF及Ets-1表达的影响。各组大鼠灌胃8周后对视网膜进行qRT-PCR法检测和采用计算机运用图像分析软件测定视网膜 VEGF和Ets-1的免疫组织化学染色阳性信号的光密度值发现：模型对照组与正常对照组对比，视网膜VEGF和Ets-1 mRNA相对表达量明显升高(P<0.05)，蛋白表达增加(P<0.01)；经多贝斯和HPS干预后，多贝斯组和HPS高、中、低剂量组的VEGF和Ets-1 mRNA相对表达量、蛋白表达明显较模型对照组低(P<0.05或P<0.01)；HPS高剂量组最接近正常对照组。结果表明：HPS能降低VEGF、Ets-1在糖尿病视网膜中的表达，且HPS高剂量效果最理想。据此推测黄芪多糖可能是通过降低视网膜中VEGF、Ets-1的含量来阻遏DR进程中新生血管生成与增殖，从而缓解DR发展进程；因此其在预防和治疗DR方面有一定的应用前景。当然，对于将黄芪多糖运用于预防和治疗DR方面还需大量的实验及临床随机对照研究，这也是课题组今后进一步研究的目标和方向。

此外，笔者在进行免疫组织化学法实验时，在眼球2种处理方法的比较中发现剥离的视网膜在浸蜡、包埋和切片时难度都较大，而且图片上色素上皮层缺失；因此，建议今后在做眼球的免疫组织化学法时不要剥离视网膜。

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(编辑陶珠)

1001-6910(2016)02-0060-04

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.02.30

金智生，教授，博士生导师，jzsgszy@ 126.com

甘肃中医药大学中青年基金(BH2012-025)

2015-07-14；

2015-11-30