基质金属蛋白酶-9和细胞外信号调节激酶1/2在哮喘中的表达及其与CCR3/RANTES信号轴的关系*

朱勇，王萍

（1.锦州医科大学第三附属医院ICU，辽宁锦州121001；2.锦州医科大学，辽宁锦州121001）

基质金属蛋白酶-9和细胞外信号调节激酶1/2在哮喘中的表达及其与CCR3/RANTES信号轴的关系*

朱勇1，王萍2

（1.锦州医科大学第三附属医院ICU，辽宁锦州121001；2.锦州医科大学，辽宁锦州121001）

目的探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和细胞外信号调节激酶1/2（ER K1/2）在哮喘中的表达水平，并进一步探讨两者与CCR 3/R ANTES信号轴的关系。方法复制小鼠哮喘模型，分为对照组、哮喘组、干预组。3组小鼠处死后进行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液，对各细胞进行计数，取右肺叶进行苏木精-伊红染色法染色，免疫荧光法检测CCR 3在支气管上皮细胞的表达。体外实验分别用活化正常T细胞表达分泌的调节蛋白（R ANTES）及R ANTES+SB328437刺激16HBE细胞，明胶酶谱法检测MMP-9的活性；用R ANTES及R ANTES+PD98059（ER K1/2阻断剂）刺激16HBE细胞，Western blot检测ER K1/2、pER K1/2及MMP-9的表达水平。结果体内实验结果证明成功复制哮喘小鼠模型。通过苏木精-伊红染色法及计数肺泡灌洗液中各细胞数量发现，哮喘组小鼠气道周围有明显的炎症细胞聚集，而干预组小鼠气道周围的炎症细胞明显减少。通过免疫荧光实验发现，小鼠支气管上皮细胞大量表达趋化因子CCR 3。体外实验结果发现，哮喘组小鼠MMP-9的活性升高，而干预组MMP-9的活性下降。用外源性R ANTES刺激16HBE细胞后发现，R ANTES可以诱导高水平MMP-9的表达，而加入ER K1/2阻断剂PD98059后30min，检测MMP-9的表达量明显降低。结论在哮喘疾病中，CCR 3/R ANTES信号轴通过ER K通路来调节MMP-9的表达。

基质金属蛋白酶-9；细胞外信号调节激酶1/2；哮喘；CCR 3/R ANTES

支气管哮喘是一种以气道炎症及气道重塑为主要病理表现的慢性气道炎症性疾病，其病理机制复杂，至今仍未完全阐明[1-2]。基质金属蛋白酶是一种钙、锌依赖的内肽酶超家族，能够降解胶原、弹性蛋白酶等大部分细胞外基质，而其中降解细胞外基质的主要限速酶为基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）。当哮喘患者急性发作时，不仅炎症细胞会产生MMP-9，肺组织细胞和支气管上皮细胞也大量表达MMP-9，使其表达水平明显上升。其与基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的平衡作用在气道壁基质沉积和结构重塑中尤为重要。目前研究认为，在气道重塑中MMP-9发挥关键作用[3-4]。活化正常T细胞表达分泌的调节蛋白（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）是由淋巴细胞、上皮细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞分泌的成熟蛋白，属于CC家族趋化因子成员，可以与CCR1、CCR3、CCR4及CCR5结合，对淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞发挥趋化作用[5-6]，并且RANTES还能协同抗原共同刺激T淋巴细胞，促进T细胞的增殖和白介素-2（Interleukin-2，IL-2）的产生，特异性的趋化嗜酸性粒细胞和记忆性T淋巴细胞[7-8]。嗜酸性粒细胞是引起哮喘炎症反应的一种重要的效应细胞[9]。气道周围有大量的嗜酸性粒细胞积聚，其在哮喘的发病中起重要作用[10]，但是调节嗜酸性粒细胞向炎症部位募集是一个复杂的机制。因此，笔者通过实验研究CCR3/RANTES信号轴的下游通路，为揭示哮喘的发病机制及免疫治疗提供方向。

1 材料与方法

1.1实验试剂

卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）购自美国Sigma公司，MMP-9（ab38898）和CCR3（ab115285）抗体购自英国Abcam公司，Anti-细胞外信号调节激酶1/2（extracellularsignal-regulatedproteinkinase1/2，ERK1/2）（V1141）购自美国Cell signaling公司，PD98059（S1177）购自美国Selleck公司，SB328437（559406）购自德国默克公司，16HBE细胞为本实验室冻存细胞株，Recombinant Human RANTES（14-8970-80）购自美国Ebioscience公司。

1.2小鼠模型的复制

18只雄性BALB/c小鼠（合格证号：SYXK-2002-0045）购自江苏省扬州大学实验动物中心，随机分为对照组、哮喘组及干预组，哮喘组小鼠于饲养第1、7和21天在大腿内侧皮下注射OVA 100μl，第28天时，将小鼠进行乙醚麻醉1mg OVA滴鼻，1次/d，持续3 d；干预组小鼠在OVA滴鼻前1h皮下注射SB328437，其余操作同哮喘组；对照组小鼠注射液体及滴鼻液体全部用生理盐水代替，处置同哮喘组。

1.3肺泡灌洗液的收集及细胞计数

小鼠麻醉后解剖，暴露气管后进行气管插管，用5ml生理盐水进行灌洗，灌入后反复冲洗后回抽，将细胞悬液离心，进行姬姆萨染色，上清液收集后冻存，用于其他检测。

灌注后取小鼠的肺脏右叶，多聚甲醛固定后常规脱水，石蜡包埋，5μm厚病理切片，常规苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后封片，于光学显微镜下观察。

1.5正常人支气管上皮细胞系细胞的培养和传代

细胞为本实验室冻存细胞，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培养细胞，待正常人支气管上皮细胞系（normal human bronchial epithelial cell line，HBE）细胞生长至80%时进行传代，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞，除去不贴壁的细胞后加入0.25%胰酶1ml，消化2min后观察细胞形态。当细胞间隙增大、边缘透亮时，加入含10%胎牛血清的达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）终止消化，吹打细胞成单个细胞悬液，离心后弃上清，用10%胎牛血清的DMEM吹打后分至新的培养瓶中继续培养。

1.6免疫荧光法检测16HBE细胞中CCR3的表达

取适量16HBE细胞（本实验室冻存细胞株），PBS洗涤后，用4%甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，滴加封闭液室温放置60min，去除多于液体后滴加一抗Anti-CCR3 antibody（1∶200），4℃过夜，PBS洗涤，滴加荧光FITC标记Goat Anti-Rabbit IgG（1∶200），室温孵育60 min，PBS洗涤3次，滴加溴化丙锭复染，室温40 min，PBS洗涤3次后荧光显微镜（OLYMPUS BX51）下观察。

1.7Western blot检测蛋白含量

将2×105个16 HBE细胞均匀种于6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，待细胞长满80%时换不含血清的改良Eagle培养基培养24h，使细胞生长同步于G0期，在同一时间点加入RANTES，继续培养24 h，收集细胞。按照Western blot试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）说明书提取总蛋白，测定蛋白浓度后，加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液，加热5min，电泳，转膜，封闭，加入二抗标记，洗涤后曝光。

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1.8明胶酶谱法检测MMP-9的活性

取方法1.3时冻存的上清液16μl，加入2×SDS上样缓冲液进行电泳，结束后根据Marker所示位置进行切胶，将切下的胶置于洗脱液（2.5%Trion X-100）进行摇摆洗脱。每15min更换1次洗脱液，1 h后移至孵育液中孵育30 min，置于37℃孵箱中孵育过夜，结束后染色1h，用脱色液进行脱色，直至出现MMP-9的条带。

1.9统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1哮喘模型的鉴定

CCR3阻断剂SB328437对小鼠哮喘应答的影响。哮喘组小鼠在最后一次OVA刺激后，有明显的咳嗽、呛咳、呼吸加快及紫绀等症状，而对照组小鼠无上述表现，干预组小鼠哮喘发作的症状不明显。为进一步验证哮喘模型复制是否成功，笔者取3组小鼠的肺组织进行HE染色，发现对照组小鼠气道周围未见明显的炎症细胞，哮喘组小鼠气道周围有明显嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的浸润，而干预组小鼠气道周围与对照组相比有少量炎症细胞浸润，但数量不多，说明哮喘模型复制成功，并且SB328437影响哮喘中气道周围炎症细胞的聚集。见图1。

图1　小鼠肺脏HE染色（×200）

2.2CCR3在支气管上皮细胞的表达

CCR3在支气管哮喘中的支气管上皮细胞发挥重要作用。笔者通过免疫荧光的实验验证支气管上皮细胞上确实有CCR3的表达。见图2。

2.3CCR3阻断剂SB328437对小鼠哮喘应答的影响

继续对小鼠进行肺泡灌洗，将灌洗液中的细胞分别进行计数，发现哮喘组小鼠肺泡灌洗液中的总细胞数、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞的数量高于对照组，说明哮喘急性发作时，肺组织内有大量炎症细胞聚集；而干预组小鼠肺泡灌洗液中的总细胞数、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞数量低于哮喘组，说明CCR3阻断剂SB328437能减少肺组织内炎症细胞的聚集，进而减轻哮喘发作时的气道反应。见附表。

附表肺泡灌洗液中各细胞数量的比较（n=6，×104/L±s）

附表肺泡灌洗液中各细胞数量的比较（n=6，×104/L±s）

注：t1、P1值：对照组与哮喘组比较；t2、P2值：对照组与干预组比较；t3、P3值：哮喘组与干预组比较

组别细胞总数巨噬细胞嗜酸性细胞淋巴细胞中性粒细胞对照组42±638±84±16±25±1哮喘组236±3481±18103±2331±1225±5干预组98±1462±2025±518±48±2 F值128.52210.50288.47917.35670.068 P值0.0000.0010.0000.0000.000 t1值15.5774.57212.6225.89010.978 P1值0.0000.0000.0000.0000.000 t2值4.5032.5652.6722.8161.653 P2值0.0000.0220.0170.0130.119 t3值11.0742.0069.9493.0749.325 P3值0.0000.0630.0000.0080.000

图2　支气管上皮细胞免疫荧光图（×400）

图5　Western blot检测ERK1/2、pERK1/2、MMP-9的表达

2.4CCR3阻断剂SB328437对MMP-9活性的影响

由于在气道炎症和气道重塑中MMP-9发挥重要作用，本实验检测MMP-9在3组小鼠肺泡灌洗液细胞中表达，结果发现，哮喘组小鼠MMP-9的活性升高，而干预组MMP-9的活性则下降，低于哮喘组，差异有统计学意义。提示MMP-9可能为CCR3/ RANTES信号轴的下游分子。见图3。

图3　明胶酶谱检测MMP-9活性

2.5RANTES诱导MMP-9的表达

CCR3通过与RANTES结合，发挥对嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞的趋化作用。本实验进一步观察RANTES对MMP-9的作用，用外源性RANTES刺激16HBE细胞，检测MMP-9的表达水平，发现可以诱导高水平的MMP-9表达，并呈时间依赖性。见图4。

图4　Western blot检测MMP-9的表达

2.6RANTES刺激ERK1/2的表达

为进一步揭示CCR3/RANTES信号轴在哮喘中的机制，本实验用外源性RANTES刺激16HBE细胞，用Western blot检测ERK1/2和pERK1/2的表达水平，发现在外源性的RANTES刺激后，ERK1/2和pERK1/2表达水平升高，同时加入ERK1/2阻断剂PD98059后30min检测发现，MMP-9表达量降低，提示ERK1/2信号通路参与CCR3/RANTES信号轴诱导MMP-9的表达。见图5。

3 讨论

随着社会的发展，环境污染逐渐严重，哮喘的发病率越来越高，而哮喘的治疗却一直停留在应用支气管扩张剂或激素治疗[11-12]。为揭示哮喘的发病机制，寻找治疗哮喘的切入点，笔者通过体内外实验探索哮喘中的信号通路。虽然在哮喘的发病过程中，CCR3/RANTES信号轴的作用已经得到证实[13-14]，但是其确切的机制仍不清楚，而MMP-9也在哮喘的气道炎症和气道重塑中发挥着重要作用，所以在本研究中，笔者分别运用体内、体外实验的方法验证CCR3/ RANTES信号轴和MMP-9在哮喘中的作用，探讨CCR3/RANTES信号轴及MMP-9的下游信号分子。

首先，本实验成功建立哮喘模型，并且通过病理切片和肺泡灌洗液的细胞计数证实哮喘急性发作时，肺组织内有大量的炎症细胞的聚集，而应用CCR3阻断剂可以减少炎症细胞的数量，提示CCR3/RANTES信号轴在哮喘的急性发作中发挥着重要作用。当笔者对哮喘小鼠进行CCR3阻断剂SB328437治疗时发现，阻断CCR3的表达能明显抑制MMP-9分子的活性。为进一步探索在哮喘中CCR3/RANTES信号轴的下游分子，笔者在体外用外源性的RANTES刺激16HBE细胞，发现MMP-9的表达水平明显增高，而用CCR3阻断剂SB328437共同刺激时，MMP-9的表达量明显下降，提示MMP-9是CCR3/RANTES信号轴的下游分子。

ERK1/2是一种可以被IL-4、IL-13、IL-17等细胞因子激活的分子，并且在哮喘小鼠中，学者发现大量活化的ERK1/2，提示ERK1/2可能在哮喘的炎症反应中发挥不可或缺的作用。由于在很多细胞中ERK通路都可以调节MMP-9的表达，笔者猜测在哮喘中CCR3/RANTES信号轴也是通过ERK通路来调节MMP-9的表达[15-16]。在实验中，笔者发现RANTES并没有促进ERK1/2的活化，但是增加ERK1/2的表达，并且当用ERK1/2阻断剂PD98059后，CCR3/RANTES信号轴作用于MMP-9的表达明显受到抑制，提示在哮喘中CCR3/RANTES信号轴的确是通过ERK通路来调节MMP-9的表达，但是在这个过程中，是否存有其他通路发挥作用，还需要进一步研究。

综上所述，笔者发现在哮喘疾病中，CCR3/RANTES信号轴通过ERK通路来调节MMP-9的表达，为揭示哮喘的发病机制及免疫治疗提供实验依据。

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（童颖丹编辑）

Expressions of MMP-9 and ERK1/2 in asthmatic mice and their correlations with CCR3/RANTES*

Yong Zhu1，Ping Wang2
（1.ICU，the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2.Jinzhou Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China）

Objective To investigate the expressions of extracellular signal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）and matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in asthmatic mice and their relationships with CCR3/RANTES. Methods After the establishment of mouse model of asthma，the mice were divided into control group，asthma group and SB328437（a specific CCR3 antagonist）intervention group.The lungs of mice were lavaged with 5ml saline，andthebronchoalveolarlavagefluidwascollectedforcountingthenumberofmacrophages，eosinophils，neutrophils and lymphocytes.The right lungs were isolated and prepared for HE staining，the expression of CCR3 in bronchial epithelial cells was detected by immunofluorescence.The activity of MMP-9 was determined by gelatin zymography after 16HBE cells were stimulated by RANTES and SB328437；then the expressions of ERK1/2，pERK1/2 and MMP-9 were detected by Western blot after the stimulation by RANTES，and RANTES plus PD98059（a specific ERK inhibitor）.ResultsIn vivoexperiment showed that amouse model of asthma was successfully established，and there was obvious accumulation of inflammatory cells around the airway through HE staining and cell counting，while there were fewer inflammatory cells around the airway in the SB328437 intervention group，high expression of CCR3 was found in the bronchial epithelial cells by immunofluorescence.In vitroexperiments revealed that MMP-9 activity significantly increased in the asthma group，while it significantly decreased in the SB328437 intervention group.The exogenetic RANTES induced high expression of MMP-9，while 30 min after adding PD98059，the expression of MMP-9 was decreased.Conclusions The CCR3/RANTES signal axis regulates the expression of MMP-9 through ERK pathway in asthma.

MMP-9；ERK1/2；asthma；CCR3/RANTES

R 256.12

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.006

1005-8982（2016）17-0029-05

2016-01-12

辽宁省科技厅联合基金（No：2015020355）

王萍，E-mail：983441262@qq.com