基于G—四联体门控制效应的铅离子适配体传感器

邓欢 孙觅 魏小平 黎洪增 李建平

摘要将富鸟嘌呤（G）序列核酸适配体与门控制效应相结合，通过控制门的开关实现信号放大，构建了新型电化学生物传感器，用于铅离子（Pb2+）的高灵敏检测。首先将单6巯基β环糊精（6SHβCD）自组装在金电极上，形成有序排列的分子自组装膜，且分子之间留有空隙，可作为探针通过的门结构。随后将发夹结构的富含G序列的核酸适配体修饰在环糊精次面端口，制得可特异性识别Pb2+的电化学生物传感器。富G序列适配体结合Pb2+后可折叠形成G四联体结构（G4Pb2+），覆盖住电极表面的探针通道，产生关门效应，使探针氧化还原电流强度减小，进而形成门控制效应，利用该效应可进行Pb2+的定量检测。门控制效应显著提高了信噪比和检测的灵敏度，在1×10

Symbolm@@ 13 ～ 5×10 Symbolm@@ 11 mol/L浓度范围内，Pb2+浓度的负对数与DPV响应电流呈良好的线性关系，检出限为3.6×10

Symbolm@@ 14 mol/L（DL=3δb/K）。传感器用于实际水样品中Pb2+的测定，结果令人满意。

关键词 电化学传感器； 门控制； G四联体； 二价铅离子

1引言

Pb2+是一種在生态系统中普遍存在的稳定、不可降解的污染物[1]，可在环境中长期积累，并对人体产生持续性影响。因此，检测水环境中的Pb2+浓度显得尤为重要[2]。近年来，发展了一些检测Pb2+的方法，包括比色法[3]、荧光法[4]、原子吸收法[5]和伏安法[6]等。核酸适配体（Aptamer）是采用配体进化指数富集方法（SELEX），从随机寡核苷酸文库中筛选得到的一类能够与靶分子特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列，包括RNA、ssDNA 或dsDNA[7，8]。核酸适配体具有良好的稳定性和选择性[3]，一些适配子可以特异性识别金属离子。Li等[9]利用具有脱氧核酶（DNAzyme）活性的核酸适配体，结合氧化石墨烯，建立了比色检测Pb2+的方法。此外，研究者们利用Pb2+与发夹型富含鸟嘌呤（G）的核酸适配体结合，使其折叠形成G四联体的强特异性配位作用，构建了多种基于G4Pb2+结构的电化学传感器 [6，10～13]以及荧光传感器[14]，然而这些传感器产生信号的效率低，灵敏度不高。

门控制效应[15] 通过利用待测物控制探针分子穿过修饰电极表面的空隙到达电极表面的数量，进而间接测定待测物浓度。门控制效应通过含量极低的待测物来控制门的闭合，从而引起高浓度探针氧化还原电流值的改变，可以提高信噪比，最终实现对检测信号的放大。

β环糊精（βCD）是由7个葡萄糖单元首尾相连成环的大环类化合物，具有疏水性空腔结构。本研究将门控制效应和核酸适配体结合，制备基于G四联体门控制效应的新型Pb2+适配体传感器。将巯基β环糊精自组装在金电极表面时，βCD分子间形成可以使铁氰化钾探针通过的空隙[16， 17]，构成了对探针氧化还原电流起控制作用的“门”。利用连接在βCD上的富G序列适配体特异性识别Pb2+离子并折叠生成G四联体，覆盖βCD分子间空隙并阻挡探针通过，形成门控制效应，使探针在电极上的氧化还原电流减小，通过测定差分脉冲伏安电流响应值实现了对Pb2+高灵敏的定量检测。2实验部分

2.1仪器与试剂

CHI660D电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；手提式压力蒸汽灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；ZHJHC2112B垂直流超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GSP7703磁力磁力搅拌器（苏北分析仪器厂）。

核酸适配体G4序列（5′TCATGGGTGGGTGGGTGGGTGANH23′，上海生工生物工程股份有限公司）； 6巯基β环糊精（6SHβCD， 山东滨州智源生物科技有限公司）；对甲基苯磺酰氯（PTSC，国药集团化学试剂有限公司）；吡啶（C5H5N，广东汕头西陇化工厂）；氨基乙酸（C2H5NO2，国药集团化学试剂有限公司）； HCl、N羟基琥珀酰亚胺 （NHS）、1乙基33二甲基氨丙基碳化二亚胺（EDC）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、Pb（NO3）2等均为分析纯；所用缓冲液为0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）；实验用水为超纯水。

2.2核酸适配体溶液的配制

TrisHClEDTA（TE）缓冲溶液：配制1 mol/L TrisHCl缓冲液，取1 mL与0.2 mL的 0.5 mol/L ETDA溶液混合，用水定容至100 mL，得到TE缓冲液（pH 7.4）。

将TE缓冲液、玻璃棒、移液枪头于120℃高温高压下灭菌20 min。冷却后取出，同移液枪一起置于超净工作台上，于紫外灯下辐射30 min灭菌。将装有适配体的离心管解冻，4800 r/min离心15 min。用移液枪移取适量的灭菌TE缓冲液，小心地注入离心管，摇匀，室温下放置过夜使其完全溶解，于

References

1Sekhar K C， Kamala C T， Chary N S， Anjaneyulu Y. Int. J. Miner. Process， 2003， 68（1）： 37-45

2Lin Y W， Liu C W， Chang H T. Talanta， 2011， 84（2）： 324-329

3Wang Z， Lee J H， Lu Y. Adv. Mater， 2008， 20 （17）： 3263-3267

4Rosen J F， Markowitz M E， Bijur P E， Jenks S T， Wielopolski L， KalefEzra J A， Slatkin D N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1989， 86（2）： 685-689

5Delves H T. Analyst， 1970， 95（1130）： 431-438

6Lin Z Z， Chen Y， Li X H， Fang W H. Analyst， 2011， 136（11）： 2367-2372

7Tuerk C， Gold L. Science， 1990， 249（4968）： 505-510

8Bock L C， Griffin L C， Latham J A， Vermaas E H， Toole J J. Nature， 1992， 355： 564-566

9Li C， Wei L M， Liu X J， Lei L， Li G X. Anal. Chim. Acta， 2014， 831： 60-64

10Hai H， Yang F， Li J P. RSC Adv.， 2013； 3（32）： 13144-13148

11MO ZhiHong， GAO YingMei， WEN ZhiYu， FAN YanPing. Chem. J. Chinese Universities， 2010， 31（11）： 2181-2183

莫志宏， 高應梅， 温志渝， 范艳萍. 高等学校化学学报， 2010， 31（11）： 2181-2183

12HAI Hong， YANG Feng， LI JianPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（6）： 841-846

海 洪， 杨 峰， 李建平. 分析化学， 2012， 40（6）： 841-846

13Zhai W， Du C Y， Li X H. Chem. Commun.， 2014， 50（17）： 2093-2095

14Li X， Wang G K， Ding X L， Chen Y H， Gou Y P， Lu Y. Phys. Chem. Chem. Phys.， 2013， 15（31）： 12800-12804

15ZHANG LianMing， LI JianPing， PAN HongCheng. Chinese J. Anal Chem.， 2012， 40（7）： 1025-1030

张连明， 李建平， 潘宏程. 分析化学， 2012， 40（7）： 1025-1030

16Rojas M T， Koeniger R， Stoddart J F， Kaifer A E. J. Am. Chem. Soc.， 1995， 117（1）： 336-343

17Cui H， Chen L， Dong Y L， Zhong S W， Guo D Q， Zhao H， He Y J， Zuo H， Li X J， Yuan Z B. J. Electroanal. Chem.， 2015， 742： 15-22

18Engeldinger E， Armspach D， Matt D. Chem. Rev.， 2003， 103（11）： 4147-4174

19Murakami T，Harata K， Morimoto S. Tetrahedron Lett.， 1987， 28（3）： 321-324

20Tabushi I， Shimokawa K， Shimizu N， Shirakata H， Fujita K. J. Am. Chem. Soc.， 1976， 98（24）： 7855-7856

21SHEN BaoJian， TONG LinHui， ZHANG HongWei， JIN DaoSen. Chinese. J. Org. Chem.， 1991， 11（3）： 265-268

申宝剑， 童林荟， 张宏伟， 金道森. 有机化学， 1991， 11（3）： 265-268

22Tabushi I， Kuroda Y， Shimokawa K . J. Am. Chem. Soc.， 1979， 101（6）： 1614-1615