生物技术在林木育种中的应用

2016-10-21王德源

吉林农业·下半月 2016年6期

摘要：林木生长周期长，受环境影响大，遗传杂合性高，增加了常规育种的盲目性。生物技术的发展为林木新品种的培育提供了新的途径。本文概述了分子标记、基因工程和细胞工程在林木遗传育种中的应用，以期为相关研究提供参考。

关键词：林木育种；生物技术；分子标记；基因工程；细胞工程

中图分类号： S722 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.12.047

森林是人类的资源宝库，不仅能够提供木材、油料、中草药材等林产品，还带来巨大的经济效益，且具有防风固沙、涵养水分、美化环境等生态效益。近年来，环境保护和可持续发展越来越受到人们的重视，对生态环境保护的要求越来越高，而人们对木材的需求量也日渐增加，因此保护现有的森林资源，营造优质人工林显得尤为重要。但林木常规育种周期长、受环境影响大，增加了育种的盲目性[1]，生物技术的运用可对林木的基因进行相应的改进，让林木生长的特性发生变化，打破种间杂交不亲和的界限，加速林木新品种的培育，有效地提高林木资源的供应[2， 3]。因此依靠生物技术手段与常规育种相结合，缩短育种周期，选育新品种，营造优质人工林，对缓解木材需求和生态环境保护的矛盾具有重要的意义[4]。随着生物技术的发展，分子标记辅助选择育种以及基因工程技术手段的应用，为加速林木新品种的选育奠定了基础[5]。

1 分子标记技术

DNA分子标记（DNA Molecular Marker）通过核苷酸序列的差异直接反映了DNA水平的遗传多态性，作为新一代的遗传标记技术，其较传统的形态标记、生化标记等遗传标记精度更高、稳定性更好、信息量更大，具有更高的多态性而更能全面的反映遗传多样性[6]。近年来，随着现代分子生物学的不断发展，DNA分子标记技术也不断发展更新，目前已广泛应用于同源性分析、基因定位、遗传育种等多个方面[7]。

1.1 主要的DNA分子标记技术

随着各种生物技术的不断发展，DAN分子标记从最初基于酶切的RFLP标记，到以PCR技术为基础的RAPD技术，再到酶切和PCR结合的AFLP技术，直至目前基于基因组测序、转录组测序、芯片技术的SNP等分子标记。目前，在所有分子标记中，RFLP、AFLP、SSR 和 RAPD 四种分子标记使用较为普遍，被广泛应用于林业研究中。

基于DNA-DNA杂交的限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP）标记是70年代末发展起来的第一代分子标记，是最早用于遗传多样性分析的DNA分子标记技术之一[8]，主要用于标记目的基因的绘制。基于PCR扩增的随机扩增多态性 DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）标记可以由扩增产物的多态性反映基因组相应区域的多态性，其操作简单快速、灵敏度高、不受基因组结构的限制且无物种特异性，具有较广的适用范围。继RFLP 之后的第二代分子标记——简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）标记，基于真核生物基因组中存在着的1～4个碱基对组成的简单重复序列，其具有较丰富的多态性，在遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面均使用广泛，但尚未开发SSR分子标记的物种开发时费用较高。酶切与PCR技术相结合的AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）标记扩增效率高，多态性、重复性和稳定性都较好，但其操作难度较大，不易实施。

1.2 DNA分子标记技术的应用

由于DNA分子标记技术具有简便快捷、准确和多态性高、不受组织类别和发育时期限制等优点，该技术被广泛应用于林木群体遗传研究[9， 10]。王佳媛等[11]通过SNP分子标记技术初步研究了凹叶木兰的遗传多样性，发现四川南部麻咪泽和美姑大风顶两个自然保护区内不同居群的凹叶木兰具有较高遗传多样性，为野生凹叶木兰保护政策的制定提供了依据。欧阳磊等[12]基于杉木基因组分子标记，利用52对SSR引物，对国家级杉木种质资源库保存的遗传材料进行遗传多样性分析，为种质资源的管理及提高育种效率提供了重要依据。

DNA分子标记也常用于林木亲缘关系研究和种质资源鉴定[13]。万爱华等[14]运用RAPD技术，对湖北京山马尾松无性系种子园123株优树针叶的分析表明各群体之间亲缘关系的远近与纬度的相关性明显，与地理距离的相关性较明显，而与经度的相关性不明显，证明了以行政区划即按省份采集优树建立马尾松无性系种子园的方法是可取的。李卫星等[15]采用ISSR分子标记分析42个银杏雄株的亲缘关系，发现雄株的亲缘关系与地区分布不完全相关，山东与江苏的部分银杏雄株试材亲缘关系较近。在林木遗传改良中，通过分子标记技术对遗传进化关系进行分析，在分子水平上阐明生物系统演化关系，有利于育种亲本的选配和种质资源的合理利用[16]。

分子标记的发展促进了林木分子遗传图谱的构建。Nelson等首次利用 RAPD标记构建了包含68个湿地松部分连锁群的遗传连锁图[16]。目前已有桉树、鹅掌楸、杜仲及多个松属树种构建了遗传图谱[16-19]。林木遗传连锁图谱的构建为控制林木重要经济性状、抗虫抗病、耐胁迫等基因的分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）定位奠定了基础，使早期选择成为可能。MAS在杂交亲本的选配、杂种实生苗的早期鉴定选择、遗传转化中目的基因的检测、雌雄异株树木幼苗的性别鉴定、多种抗病性状同时筛选等方面均有应用[20]。

2基因工程技术

基因工程是现代生物技术的核心，为林木遗传改良提供了一条新的途径[4， 21]。将外源目的基因导入目标植物基因组中，使其在新的遗传背景中产生新的表型性状。基因工程技术可打破种间杂交不亲和的界限，根据人们的意愿去改造林木品种的遗传特性，创造出新的遗传变异和育种资源[21]。该技术在大豆、玉米等农作物育种中已经得到了大量的成功应用，但在林木中的应用起步较晚，目前主要在杨树、桉树等树种中研究较为深入，目的基因有抗蟲抗病基因、抗逆基因、材性相关基因、促进开花的基因、生长性状改良基因、抗环境污染基因等[4]。

2.1抗性相關基因工程

近年来，国内外研究人员已为多种树种进行了抗虫抗病、抗除草剂、抗旱、抗盐和抗寒等方面的基因工程研究，分别获得几十个相关抗性的基因，并在杨属、松属等林木树种中获得了转基因植株。如将来自水稻的半胱氨酸蛋白酶抑制因子OCI基因转入杨树杂种无性系NIRA353-38，提高了它们对节肢动物及病原性害虫的抗性[22]。欧洲栎和欧美杨的脱水素基因QrDhn1、QrDhn2、QrDhn3、peudhn1均能够响应外部缺水条件，具有增强植物脱水耐性的功能[5]。白桦脂肪酸生物合成基因BpFAD3、BpFAD7和BpFAD8能提高白桦抗寒能力。

2.2 材质相关基因工程

利用基因工程手段调控4CL、CAD、C3H、MYB、CCR、COMT、CCoAOMT等基因，进而调控木质素和纤维素的合成，降低纸浆材的木质素含量，可提高纸浆得率，减少能耗，改善环境。MYB转录因子PtrMYB3、Ptr-MYB20及NAC转录因子PtrWND2B、PtrWND6B均被证实参与纤维素和木质素的生物合成，参与调控木材形成[5]。

2.3生殖相关基因工程

林木生长周期长，限制了林木育种及遗传改良进程，通过基因工程手段可促进林木提早开花缩短育种周期。如一般的野生型杨树需8～20 年才能开花，而转LFY基因的杨树仅5个月就可开花[4]。利用基因工程手段还可以培育不育的转基因林木新品种而有效减少转基因花粉引起的基因逃逸，如王冬梅等对PtAP3基因正反义表达载体进行研究，以期干扰开花使毛白杨等树种花器官败育而控制飞絮污染。

2.4生长性状改良基因工程

通过基因工程技术可调节树木内源激素平衡、改良林木生长性状。有研究表明，转入rolA、B、C基因的植物，促进根的形成和发育的同时可促进植株地上部分的生长、发育，转入 rolC 基因的杂种杨树表现出顶端优势降低、节间缩短、植株矮化，这对林木种子园的管理具有重要意义。

3细胞工程技术

植物细胞具有全能性，在适宜条件下，一个植物细胞可形成一个完整的植株[23]。林木细胞工程基于全能性，对不同组织、细胞进行细胞杂交等各种遗传操作，改变细胞的遗传基础，加速个体繁殖，选育优良品种或新品种。随着对优良造林苗木需求及濒危植物保护任务的增加，细胞工程技术在林木快速繁殖、种植资源保护、新品种选育等方面也具有重要作用。目前在原生质体培养、体细胞胚胎发生、植株再生、人工种子、细胞杂交和体细胞突变体的筛选与利用等方面已取得了令人瞩目的进展[22]，已成功应用于香椿、梨、苹果等50多种经济林木。

3.1体细胞胚胎发生和人工种子

体细胞胚再生容易，繁殖效率高，同时后代具有较好的稳定性，是人工种子和转基因良好材料。马尾松、杨树等30多种木本植物已经获得了体胚。华山松、核桃、挪威云杉、杉木、杂交鹅掌楸等树种已经通过体胚发生获得再生植株。近年来，南京林业大学施季森教授团队与多家单位合作，累计生产交鹅掌楸体胚苗900 多万株，杉木优良无性系组织培养和体胚培养苗木6000 多万株。桑树、云杉、桉树等木本植物已成功利用体胚制成了人工种子。

3.2原生质体培养及体细胞杂交

原生质体已成功用于体细胞杂交、原生质体转化、外源基因导入等。目前，部分杨属、松属及北美鹅掌揪、桉树等木本植物已利用原生质体培养获得了再生植株。体细胞杂交通过细胞的融合产生杂种，不经有性过程，克服了远源杂交不亲和的问题，为新品种的培育提供了一个新的途径。

4结语

近年来，生物技术已广泛应用于林木种质资源和遗传改良研究领域。目前，利用基因工程技术获得了林木速生优质、抗虫、抗病、抗寒、抗旱、耐盐等新种质；利用DNA分子标记构建了多种林木树种的遗传图谱并定位到一些重要性状的基因。然而，与农作物相比，林木育种在分子生物学技术研究与应用方面还较为落后，还存在许多问题有待研究，如应注重转基因林木的田间试验与稳定性和安全性评价。虽然生物技术在林木遗传改良的研究和实际应用过程中还存在着一些问题[24]，但随着相关科学理论及技术手段的不断发展和完善，相信在不久的将来它将在林业自然资源保存、林木育种效率的提高及林木种质创新等领域起到关键作用。

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