高效液相色谱法测定澳洲坚果青皮中的4种酚类物质

刘秋月 叶丽君 黄文烨 黄雪松

摘 要 为开发利用澳洲坚果青皮，采用高效液相色谱法（HPLC）研究其对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的测定方法和含量。结果表明，澳洲坚果青皮中，4种多酚的最佳测定条件为：以1% 乙酸水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱（0 min，87% A；5 min，85% A；25～30 min，60% A），检测波长260 nm，流速0.8 mL/min。并测得青皮中对羟基苯甲醇、3， 4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的含量分别为（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.00 9）mg/g。该方法简单、高效、实用。

关键词 澳洲坚果 ；对羟基苯甲醇 ；3，4-二羟基苯甲酸 ；对羟基苯甲醛 ；对羟基苯甲酸 ；青皮

中图分类号 S664.9 ；TQ245.6 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.021

澳洲坚果（Macadamia ternifolia F. Muell）又名昆士兰果、昆士兰栗、澳洲胡桃、夏威夷果等[1]，因其果仁风味独特、营养丰富而被誉为“干果皇后”。随着我国农业产业结构的调整，我国澳洲坚果近年来获得空前发展，种植面积已近4万hm2[2]，年产干果近万吨，除果仁直接食用、少量果壳（种皮）制作木炭外[3-5]，其绿色的果皮（俗称青皮，占整果鲜重的45%～60%）仅有极少量用作沤肥或饲料，绝大部分被丢弃，亟需开发利用。

研究表明，澳洲坚果果仁中含有酚类酸、维生素E、甾醇等抗氧化活性成分[6-9]；芦燕玲等[10]用萃取和气相色谱-质谱联用法分离鉴定出澳洲坚果壳中含有酸类；张明楷等[11]对6种澳洲坚果青皮中的单宁含量进行了测定。根据植物化学成分分析，澳洲坚果皮中应含有大量多酚类物质，需要首先研究其化学成分，以便有针对性地开发利用。施蕊等[12]报道澳洲坚果青皮中含有熊果苷、豆腐果苷等化学成分，但这不足以解释其具有杀菌、抗氧化等多种生物活性。本研究课题组从澳洲坚果青皮中分离得到晶体状态的3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛和对羟基苯甲醇4种酚类化合物（鉴定结果将另文发表），这4种酚类物质都有一定抗氧化或杀菌的作用，即它们可以部分地解释澳洲坚果青皮具有防腐杀菌和抗氧化[13]等功能与活性。

本研究旨在建立一种快速、准确测定澳洲坚果青皮中4种酚类物质的HPLC分析方法，以为该资源的进一步开发、利用、产品的质量控制等提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

澳洲坚果果实，由广西南亚热带农业科学研究所王文林老师课题组馈赠。

1.1.2 主要仪器及试剂

本研究使用的主要仪器：Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪及配套SPD-M20A光电二极管阵列检测器（DAD）（日本岛津公司）；3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛标准品（AR级，阿拉丁试剂有限公司）；冰乙酸（AR级，天津化学试剂一厂）；甲醇（HPLC级，欧普森试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

取自然干燥的澳洲坚果青皮磨成粉末，用70%的乙醇提取3次，合并提取液，50℃下旋转蒸发除去溶剂，乙醇定容至50 mL，过0.45 μm滤膜，待测。

1.2.2 色谱条件的优化

通过扫描得到流动相和各单体酚类物质在紫外光区的最大吸收波长，选择能同时测定以上4种酚类物质、又能避开溶剂吸收的适宜波长。流动相、流速、洗脱方式等都会对目标物质能否单独出峰不受其它杂质干扰造成影响，进而影响样品与标准品的对比，无法进行定性测定。通过调整流动相体系、梯度洗脱比例和流速、改变进样量等获得快速分离测定目标物质的最优条件。

1.2.3 标准曲线的绘制

精确称取标准品3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛，对羟基苯甲醇100 mg，分别用甲醇定容至10 mL，得到每个标准品的单标储备液。

分别移取50、100、150、200、250 μL 3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的标准溶液，20、30、40、50、60 μL对羟基苯甲酸标准溶液和4、6、8、10、12 μL对羟基苯甲醇标准溶液，用甲醇定容至50 mL，得到不同梯度的酚类混合标准溶液，每个浓度重复进样6次，以各单体酚的平均峰面积（y）与标准溶液中物质的浓度（x）做校准曲线，计算标准曲线回归方程及相关系数。

1.2.4 检测限和定量限

将一定浓度的标准溶液逐级稀释，进样，当信噪比等于3时，所对应的标准溶液中所含组分的量为最低检测限；当信噪比等于10时，所对应的标准溶液中所含组分的量为定量限。

1.2.5 加标回收测定

已知酚类物质含量的青皮提取液中，定量添加各酚类物质标准品，平行制备6份，并精确吸取10 μL进样，计算各酚類物质的加标回收率。

1.2.6 重复性和仪器精密度测定

按上述方法重复制备6份样品进样，记录峰面积，计算峰面积相对标准偏差（RSD），检测方法的重复性。 同一样品分3 d进行实验，每天精确进样10 μL，连续进样6次，记录峰面积，分别计算日内和日间峰面积RSD值，比较日内和日间仪器的精密度。

1.2.7 样品稳定性测定

取同一样品室温下放置，并于样品制备后的0、2、4、8、12、16、24、36、48 h进样，每次进样10 μL，测定峰面积，计算RSD值。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

对4种酚类标准品进行全波长扫描，得到其在紫外光区的吸收图谱（图1），由此得到各单体酚类物质的最大吸收波长（表1），为了能同时测定这几种物质又能减少溶剂的影响，最终确定检测波长为260 nm。

2.1.2 流动相的选择

分别尝试用1%乙酸水溶液-乙腈和1%乙酸水溶液-甲醇作流动相，当流动相含有乙腈時，即使含量较少，出峰时间也比较早，且4种酚类物质峰分离效果不佳；当流动相含有甲醇，且含量较低时，峰形则大大改善（图2），故改用甲醇和1%乙酸水溶液作为流动相。

2.1.3 流速的选择

实验采用0.5、0.8、1.0 mL/min 3个流速，见图3。结果发现，流速为0.5 mL/min时，分离效果好，但耗时较长；流速为1 mL/min时，用时短，但前2个峰出峰时间十分接近且最后的对羟基苯甲醛有肩峰，分离效果不佳；流速为0.8 mL/min时，可以在30 min内把4种酚类物质较好地分开。

2.1.4 色谱条件的最终确定

根据以上实验，确定了澳洲坚果青皮4种酚类物质的HPLC测定条件，进样量为10 μL，柱温箱为40℃，且为了缩短检测时间，采用浓度梯度洗脱，逐渐加大甲醇含量，以达到良好的分离效果，其梯度洗脱程序见表2。在此条件下得到了4中多酚混合标准溶液的液相色谱图和样品溶液的液相色谱图（图4）。

从图4-B可以看出，对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛4种物质均可以在相应的标样图4-A上予以确认（即据保留时间相同的原则予以定性鉴定）；另外，我们还比较了它们的紫外可见光谱也是一致的，这与原有鉴定结果一致（资料未发表）。因此，用该方法定性测定澳洲坚果青皮中的上述4种酚类物质是可行的。

2.2 标准曲线和检测限

按上述色谱条件测得4条标准曲线，r值均高于0.99，所以得到的线性方程能满足实验条件，其线性方程、检测限等见表3。

2.3 加标回收率

加标回收率测定结果见表4，结果显示，4种酚类物质的回收率在99%～102%。

2.4 重复性

按上述方法对样品6次进样，计算对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的峰面积RSD值分别为0.6%、0.1%、1.5%、0.4%，表明该方法重复性良好。

2.5 精密度

根据实验结果，计算第一天对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的峰面积RSD分别为：1.7%、0.7%、2.4%、0.3%；第二天各种组分的峰面积RSD分别为：2.2%、1.2%、2.0%、0.3%；第三天各种组分的峰面积RSD分别为：1.9%、0.3%、1.8%、0.3%。均小于3%，表明日内仪器精密度良好；日间比较各组分的峰面积RSD为：1.8%、1.0%、2%、0.4%，表明仪器的日间精密度良好。

2.6 稳定性

不同时间进样，测定峰面积，计算对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的峰面积RSD值分别为1.9%、1.0%、3.3%、1.0%，表明供试样品在48 h内稳定性良好。

2.7 样品的测定

按上述方法制备样品并进行色谱分析，测定3次取平均值，测得干燥的澳洲坚果青皮中对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛的含量分别为（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.009）mg/g。

3 讨论与结论

3.1 讨论

酚类化合物的研究对澳洲坚果青皮的开发利用、尤其是开发具有防腐杀菌、抗氧化功能保健食品、漱口水等具有重要意义，目前澳洲坚果青皮中的酚类物质还未见报道，本研究所鉴定的4种酚类物质在其它物质中也未见同时报道。

在样品前处理简单、杂质较多的情况下同时分离并检测此4种酚类物质具有一定的难度。本研究采用保留时间和二极管阵列光谱图相结合的方法进行定性、进而进行定量测定，建立了一种新的、同时测定上述4种酚类物质的高效液相色谱分析方法。

3.2 结论

研究结果表明，以1%乙酸水溶液-甲醇作为流动相进行梯度洗脱（0 min，87% A；5 min，85% A；25～30 min，60% A），30 min内各组分的色谱峰分离效果较好、色谱峰峰形好。实验以对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛标准品测得的标准曲线分别为y=4 024.22x-48 847（r=0.999 6）、y=54 654.4x-105 270（r=0.998 9）、y=54 654.4x-105 270（r=0.999 3）、y=66 922.4x-89 492.6（r=0.999 5）；且前述4种酚类的最低检测线在0.04～0.9 μg/mL，加标回收率在99%～102%，样品中含量分别为（1.3±0.12）、（0.19±0.001）、（0.046±0.003）、（0.15±0.009）mg/g。该方法前处理简单，样品稳定，重复性好，操作简单快速，准确性高。

参考文献

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