MreB在钝顶螺旋藻中的表达和定位

吴 娟, 金晨钟, 胡一鸿, 胡军和, 竺锡武, 徐 虹



MreB在钝顶螺旋藻中的表达和定位

吴 娟1, 2, 金晨钟1, 胡一鸿1, 胡军和1, 竺锡武1, 徐 虹2

(1. 湖南人文科技学院农业与生物技术学院, 湖南娄底 417000; 2. 厦门大学生命科学学院, 福建厦门 361102)

为了研究MreB在钝顶螺旋藻形态建成中的作用, 克隆了基因并进行原核表达, 对表达的融合蛋白进行了纯化, 免疫小鼠制备了MreB的多克隆抗体, 分别用Western blot和免疫荧光技术检测不同形态藻丝体中MreB的表达和定位, 结果显示MreB表达量在螺旋形和直线形两种藻丝体中无明显差异; 免疫荧光定位显示, 荧光主要分布于细胞膜下一圈, 侧面可观察到荧光呈双股螺旋状分布。实验结果说明, MreB含量不是导致螺旋藻形态改变的因素, MreB细胞骨架蛋白参与指导细胞壁肽聚糖的合成, 所以有可能通过其双螺旋结构在藻细胞中的不对称分布影响螺旋藻的形态。

螺旋形藻丝体; 直线形藻丝体; 细胞骨架蛋白

螺旋藻(), 又称节旋藻(), 是一种光合放氧的原核丝状微藻, 藻丝是由许多圆柱状细胞连结而成的单列丝状体, 其典型的形态学特征呈疏松或紧密的有规则的螺旋形或波浪形, 两端钝圆, 无分枝、无异形细胞。但是螺旋藻无论是在实验室培养还是生产条件下都存在多形性变异现象[1]。有时在同一水体中的同一种螺旋藻形态也会有所不同, 据报道,当培养温度和光照强度增高时, 螺距变小; 而在光密度很低情况下, 螺距很长, 超过100μm[2]。彭卫民等从正常培养的藻液中分离得到了颜色、长短、粗细均与螺旋形藻丝体相同的直线形变异藻株[1]。

原核细胞骨架蛋白MreB是真核肌动蛋白的类似物, 在维持细菌杆状形态的功能中起了重要的作用[3-4]。它能在细胞生长或分裂时期分别在膜内侧形成螺旋形或环状结构, 并以此动态结构作为平台, 在其上招募一些肽聚糖合成相关酶, 指导肽聚糖的合成, 形成新生细胞壁, 从而使细胞产生和保持特定的形态[5-7]。为了研究MreB在螺旋藻形态建成中的作用, 我们钓取了螺旋藻mreB基因序列, 克隆、表达、纯化了钝顶螺旋藻(FACHB869S)的MreB蛋白, 免疫小鼠并获得相应的多克隆抗体, 用免疫印迹和间接免疫荧光标记技术对其表达量和细胞定位进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

限制性内切酶、DNA Marker、T4DNA连接酶、酶等购自大连宝生生物有限公司; 山羊抗小鼠IgG-HRP 购自北京博大泰克生物基因技术公司; PVDF膜为MILLIPORE公司产品; 质粒提取试剂盒购自加拿大BIO BASIC公司; 荧光二抗(Fluorescein Conjugated Affinity Purified anti-Mouse IgG[Goat])购自美国Rockland 公司; IPTG、弗氏完全佐剂和不完全佐剂、丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS、巯基乙醇、DTT、Triton X-100、尿素、TEMED、过硫酸氨、考马斯亮兰G250, 等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 其余试剂和药品均为国产分析纯试剂和药品。所有测序工作均由金思特科技(南京)有限公司完成。

FPROGO5D型PCR仪(美国 BIO-RAD公司); 超声破碎仪(美国VirTis公司); 多用电泳仪(美国VirTis公司); Mini-PROTEAN 3 蛋白电泳系统(美国 BIO-RAD公司); 小型 Trans-Blot 电转印系统(美国 BIO-RAD公司); 荧光显微镜(日本Nikon公司)。

1.2 藻种、菌种与质粒

实验采用的钝顶螺旋藻, FACHB编号分别为: 869和882, 分离的两种形态分别标注螺旋形(spiral, S)、直线形(linear, L), 均购自中科院武汉水生所, 本实验室保存。大肠杆菌BL21(DE3)plysS和质粒pGEX-6P-1由本实验室保存。

1.3 实验方法

1.3.1基因的扩增

按照茅云翔等的方法[8]提取钝顶螺旋藻全基因组DNA, 以它为模板, 用引物P1: 5- AAGGAT CCATGGGCATAGACCTAGGAACCG-3; P2: 5-GAG AATTCCTACGGA TTTTGTG ATTGTCGTG -3(上海生工生物工程有限公司合成)进行扩增。反应液为50μL, 含有1×PCR buffer, 200μmol/L dNTP, 1.5mmol/L MgCl2, 0.6μmol/L引物, 50ng模板DNA, 2.5U酶。扩增条件为94℃预变性5min, 然后94℃ 45s, 58℃ 45s, 72℃ 90s, 35个循环, 最后于72℃保温10min。扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2质粒的构建

将以P1、P2为引物, PCR扩增的基因用H Ⅰ和R Ⅰ双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳后挖胶回收1.1kb大小的mreB片段, 连接到经同样双酶切的pGEX质粒中, 通过测序确保插入的基因与质粒的阅读框架一致。

1.3.3目的蛋白的诱导表达

将重组表达质粒pGEX-转化BL21 (DE3)plysS, 然后涂布120 μg/mL Amp LB 培养基固体平板, 37℃培养过夜。挑取单菌落于4 mL LB 液体培养基(Amp100 μg/mL)摇至600=0.8~1.0时将菌液转接于100 mL 培养基, 37℃摇至600= 0.7左右时, 加IPTG 至终浓度0.5 mmol/L, 然后将菌液转至28℃诱导6h。5000 r/min 离心10min收集诱导培养的菌体, 将诱导的菌液经超声破碎后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE 电泳以分析蛋白的表达状态。

1.3.4目的蛋白的纯化

收集经IPTG诱导培养的菌体并重悬于PBS缓冲液中超声破碎, 15000r/min离心10min取上清过预先平衡好的GST -Resin纯化柱; 以20倍柱床体积的PBS缓冲液漂洗柱子; 1mL洗脱缓冲液(含6mM 还原型谷胱甘肽的PBS溶液)将目的蛋白从GST-resin纯化柱上洗脱并收集。收集组分进行SDS-PAGE分析。

1.3.5多克隆抗体的制备

用原核表达并纯化的GST-MreB免疫昆明小鼠。免疫前每只小鼠取20 μL 血清作为阴性对照备用。首次免疫用弗氏完全佐剂乳化GST-MreB 后, 采用腹腔和皮下多点混合注射, 腹腔注射100 μL, 皮下各点25 μL, 蛋白用量为200 μg/只。此后每隔7d 加强免疫一次, 共3 次。加强免疫用弗氏不完全佐剂, 所用剂量同首次免疫。30d 后摘眼球取血, 4℃静置过夜, 取血清, –20℃保存。

1.3.6Western-blot 检测

不同形态藻丝体总蛋白进行SDS-PAGE, 电转移到PVDF 膜上, TBS 洗膜; 用含5%脱脂奶的TBST37℃封闭30min, TBST 洗膜; 一抗 1︰1000 稀释, 分别加到相应的PVDF 膜上室温孵育1h, TBST 洗膜; 加入1︰2000 稀释的羊抗鼠IgG-HRP 室温孵育1h, TBST 洗膜; 用化学发光法显色定影于底片; 使用Image-Pro Plus 软件进行蛋白定量分析, 分析结果来源于3次独立实验。

1.3.7MreB的免疫荧光定位

培养螺旋藻至560为 0.5~ 1.0, 4000 r/min 离心收集藻细胞, 加入适量PBS重悬藻细胞, 超声波处理5 次, 输出功率为5 W, 每次2s; 低速离心收集藻细胞, 用1.5 mol/L NaCl的Zarrouk培养基洗去细胞外壁的胶质鞘; 低速离心收集藻细胞, 转入酶解液(0.2 mol/L磷酸钾缓冲液pH7.2, 渗透稳定剂KCl 0.8 mol/L, 0.5%溶菌酶)中, 在28~30℃水浴低速震荡下酶解1 h, 用PBS 洗涤3 遍, 每次5min; 用4%多聚甲醛常温固定30min, PBS 洗涤3次; 冰甲醇处理5min, 冰丙酮处理30s; PBS 洗涤3次; 用含1% BSA的PBS封闭藻细胞1h, 加入小鼠多克隆抗体, 4℃孵育过夜; PBS 洗涤3次后, 用FITC标记的羊抗鼠荧光二抗孵育1h; PBS 洗涤4 次, 取一滴藻液于载玻片上, 加一滴防荧光萃灭剂, 盖上盖玻片, 用指甲油封片, 荧光显微镜下观察MreB的细胞定位。

2 结果

2.1 钝顶螺旋藻的克隆

取560为0.8左右的螺旋藻藻液50 mL, 离心后提取藻总DNA, 以总DNA 为模板, P1和P2为引物PCR扩增基因, 扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果表明, 扩增产物的大小约为1100 bp, 与预期结果相符合(图1)。

2.2 融合表达载体pGEX-的构建和鉴定

为了研究MreB在螺旋藻中的表达和定位, 需要将MreB进行外源表达纯化后制备多克隆抗体。首先将经P1、P2 扩增并测序正确的片段用HⅠ+R Ⅰ双酶切, 然后与同样双酶切的载体pGEX连接, 以构建原核表达质粒pGEX-。连接产物转化DH5α, 经Amp抗性筛选后挑取阳性克隆菌落进行酶切鉴定。重组质粒经H Ⅰ+RⅠ双酶切后进行电泳检测, 结果显示pGEX载体中已连入1100 bp 的单一片段(图1)。该重组质粒经测序证实阅读框正确。

M1. DL2000 DNA Marker; M2. λDNA/RI +dI Marker; 1. PCR production of; 2. pGEX-6P-1/HI; 3. pGEX- 6P-1-/HI; 4. pGEX-6P-1-B/HI +RI

2.3 MreB蛋白的表达纯化

将鉴定正确的重组质粒pGEX-6P-1-转化表达菌BL21, 用0.4mmol/L的IPTG 28℃诱导12 h, 提取菌体总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明, pGEX-6P-1转化菌诱导后比诱导前多一条分子量26ku的特异性GST蛋白条带(图2中的2), pGEX-6P-1-转化表达菌株在约62ku处出现一条特异性蛋白条带(图2中的3和4)。将诱导的菌液经超声破碎后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析, 结果表明, GST-MreB融合蛋白主要存在于上清中(图2中的5), 在上清中占总蛋白的50%以上。用GST.Bind resin纯化, 纯化后的GST-MreB融合蛋白经过SDS-PAGE分析表明, 纯度都达到90%以上, 可用作抗原免疫小鼠。

1, 2. 分别为pGEX-6P-1转化菌诱导前、后总蛋白; 3, 4. 分别为pGEX-6P-1-转化菌诱导前、后总蛋白; 5, 6. 分别为转化菌菌体裂解物上清, 沉淀; 7. 割胶纯化后的GST-MreB

1, 2. Cell lysates respectively fromtransformed with empty pGEX-6P-1without or with IPTG induction (negative control); 3, 4. cell lysates respectively fromtransformed with pGEX-6P-1-without or with IPTG induction; 5, 6. soluble protein or insoluble protein fromtransformed with pGEX-6P-1-under IPTGinduction; 7. GST-MreB protein purified by GST.Bind resin agarose chromatograph

2.4 MreB抗体制备与检测

用纯化得到的融合蛋白作为抗原, 分别用弗氏完全佐剂充分乳化后, 按每只200μg来免疫小鼠, 第3周开始每隔一周加强免疫一次, 3次加强免疫后眼球取血, 分离血清得到融合蛋白的多克隆抗体。

为了检测抗体的特异性, 我们用所制备的抗体与钝顶螺旋藻的总蛋白进行了Western blotting, 以BL21转化菌的纯化蛋白为阳性对照, 抗体工作浓度为1︰1000。杂交结果显示(图3), 制备的抗体能与转化菌中融合表达的GST-MreB蛋白产生特异性反应, 同时也能与钝顶螺旋藻总蛋白产生杂交信号, 杂交带的大小约为36ku, 符合MreB的大小, 且杂交信号基本单一, 背景干净, 没有其他非特异性杂交信号干扰。这说明, 我们以在BL21中表达的融合蛋白GST-MreB为抗原所制备的抗MreB抗体的特异性较好, 效价较高, 可用于钝顶螺旋藻中MreB的表达检测。

1: pGEX-6P-1-转化菌诱导前总蛋白; 2: pGEX-6P-1-转化菌诱导后总蛋白

1: Total protein fromtransformed with pGEX-6P-1-without IPTG induction; 2: Total protein fromtransformed with pGEX-6P-1-with IPTG induction

2.5 不同形态螺旋藻藻丝体中MreB蛋白的表达检测

为了研究螺旋藻不同形态藻丝体的细胞骨架蛋白是否存在表达差异, 我们用所制备的钝顶螺旋藻MreB抗体与钝顶螺旋藻FACHB 869和882的螺旋形和直线形藻丝体的全蛋白进行了Western blot。采用筛绢过滤收集藻丝体, 以藻泥质量作为粗略的定量, 提取全蛋白后, 根据紫外吸收法测定蛋白浓度和SDS-PAGE的跑胶结果, 用缓冲液调整各蛋白样品的浓度。为了更为准确的分析, 在Western blot检测的过程中, 我们以生物钟蛋白KaiC作为内参, 4种螺旋藻处于光暗(Dark 12h/Light 12h)周期诱导3d, 以便同步生物钟蛋白KaiC的节律[9]。通过Image-Pro Plus软件分析两者的丰度比值, 对比目标蛋白在细胞内的表达情况。

在不同形态螺旋藻藻丝体中均能检测到MreB特异性条带, 大小约为36ku, 背景干净(图4)。从Image-Pro Plus 软件分析结果可以看出(图5), MreB的表达量在螺旋藻Spirulina platensis FACHB 882中直线形藻丝体比螺旋形稍高; 对于螺旋藻Spirulina platensis FACHB 869, 螺旋形藻丝体的MreB表达量比直线形稍高, 总体来看, MreB表达量在螺旋形和直线形两种藻丝体中差异不明显。

2.6 MreB在螺旋藻中的免疫荧光定位研究

按照方法1.3.7, 用带荧光素FITC的荧光二抗免疫杂交检测螺旋藻FACHB 869L和869S MreB蛋白的分布。因为螺旋藻有很厚的细胞壁, 且细胞壁外有胶质鞘覆盖, 抗体很难直接进入胞内, 所以参照文献[10]先用较高浓度的盐处理可快速去除螺旋藻细胞外胶质鞘, 再用溶菌酶处理更有利于抗体进入胞内。但是溶菌酶也会作用于藻丝体中单个藻细胞之间相连的细胞壁, 藻丝体变成一个个藻细胞。可能是FACHB 869S的细胞壁比FACHB 869L更厚更坚实, 所以FACHB 869S的免疫荧光检测效果不好(图6B), 只有869L可以明显的观察到细胞内部荧光信号。在有荧光信号的藻细胞中, 荧光主要分布于细胞膜下一圈, 紧贴着细胞膜(图6A白色箭头所示); 藻细胞是扁圆柱状, 侧面可观察到荧光呈双股螺旋状分布(图6A白色箭头所示)。

A. 869LMreB免疫荧光定位; B. 869S MreB免疫荧光定位

A. Immunofluorescence analysis for MreB location in linear filaments; B. Immunofluorescence analysis for MreB location in spiral filaments

3 讨论

关于螺旋藻的直线突变株早就有报道, 我们实验室从中科院武汉水生所购买的藻种里也含有两种形态的藻丝体, 作者将其分离出来, 各自培养, 它们能长期保持其形态(至少在我们分离后的这四年里保持其形态), 未发生形态突变。生产上, 变直的螺旋藻不能适应高光强的生长环境、产量急剧下降、质量变差、藻丝体难以采收等一系列严重问题, 而带来巨大的经济损失[11-12]。因此, 迫切需要研究螺旋形态建成的外界影响因子及内在调控机理, 以指导生产实践, 并进一步探索原核生物形态建成这一重要课题。根据我们实验室之前所做的两种螺旋藻蛋白表达差异分析, 对这些差异点的MALDI-TOF质谱鉴定, 数据库比对分析, 选择了细胞骨架蛋白MreB进行深入研究[13]。真核细胞骨架早已研究得较清楚了, 它们在细胞形态决定上起着重要的作用[14]。原核细胞形态更加多样, 如球状、杆状、螺旋状、月牙状等, 而原核生物细胞骨架是近十年才发现的, 其机理尚不是很清楚, 目前普遍认同的观点是细胞的形状是由细胞骨架决定的, 并且通过结实的细胞壁的形成固定的。

本论文从原核细胞骨架蛋白MreB的角度出发, 探讨螺旋藻形态建成与原核细胞骨架蛋白MreB之间的关系。利用免疫印迹(Western blot)技术检测MreB 蛋白在钝顶螺旋藻不同形态藻丝体中的表达情况, 发现MreB表达量在直线形藻丝体和螺旋形藻丝体中没有明显差异。以上实验结果说明螺旋藻由螺旋形突变成直线形, MreB的含量改变不明显, MreB含量不是导致螺旋藻形态改变的因素。

MreB作为主要原核细胞骨架蛋白之一, 其在细胞膜内侧形成一个螺旋形的结构, 从细胞内部起到刚性的支撑作用, 而其更重要的作用在于, 作为一个平台, 在其上招募一些肽聚糖合成相关酶, 指导肽聚糖的合成[5, 7, 15]。如果形成螺旋形藻丝体, 则每个细胞两侧的细胞壁是不对称生长的, 而直线形突变株两侧的细胞壁是平衡生长的。Vats P等[16]报道, 在中GFP-标记的MreB蛋白在荧光显微镜下, 有双螺旋、双环、单环三种主要的定位方式。螺旋状分布与环状分布是相互转换的, MreB相关细胞骨架随着细胞周期改变其结构模式[17]。细胞分裂时, MreB纤维由原来扩展的螺旋状态缢缩为环状定位于细胞未来分裂位点附近, 单环随后转变为双环位于Z环(又称为细胞分裂环)的两侧, 双环逐渐分开, 环分配到每个细胞的一极[18-19]。用间接免疫荧光技术检测螺旋藻MreB分布, 因为螺旋藻具有坚实的细胞壁, 如果不用溶菌酶对细胞壁进行部分降解, 一抗和二抗无法进入胞内, 我们能够观察到二抗荧光信号的都是细胞壁部分降解而形成的单个藻细胞。从藻细胞的横截面, 可以看到荧光主要分布于细胞膜下一圈, 这与细菌中MreB细胞骨架沿细胞长轴螺旋状环绕于细胞膜内侧是一致的[17]; 藻细胞是扁圆柱状, 长度很短直径很大, 从侧面可看到荧光的双股螺旋状分布。这些说明螺旋藻中MreB的分布与菌中类似, 但是螺旋藻细胞的MreB双螺旋比菌的螺距短、螺旋度大, 这是因为藻细胞是扁圆柱状, 大肠杆菌比藻细胞长, 而直径则比藻细胞小, 这类似于将一根螺旋丝拉长了, 螺距就变大了, 螺旋度就变小了, 这也反映了MreB对细胞宽度及长度的调控作用[6, 20]。

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Expression and Localization of MreB in

WU Juan1, 2, JIN Chen-zhong1, HU Yi-hong1, HU Jun-he1, ZHU Xi-wu1, XU Hong2

(1. Institute of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China; 2. School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)Received：Oct. 9, 2015

spiral filament; linear filament;; cytoskeletal protein

To explore the function of MreB in morphogenesis of, we clonedgene into expression vector pGEX-6P-1 and expressed GST-tagged MreB in. The purified MreB protein was used to immunize mice to prepare polyclonal antibodies. No obvious differential expression of MreB was detectedby western blot analysis between the spiral filaments and linear forms of. Immunofluorescence analysis showed that MreB was distributed as a ring or double helix under the cell membrane. These results showed that MreB might not directly regulate the shapes of the cell. The helical MreB cytoskeletal protein directs the synthesis of lateral peptidoglycan by providing a track, therefore, it may affect the morphogenesis ofby the asymmetric distribution.

Q942.3

A

1000-3096(2016)07-0017-06

10.11759/hykx20140323003

2015-10-09;

2016-03-22;

国家自然科学基金项目(40306024, 31301978); 湖南农田杂草防控协同创新中心资助项目

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.40306024, No.31301978; Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control]

吴娟(1984-), 女, 湖南娄底人, 讲师, 研究方向: 植物分子生物学, E-mail: wujuan20022499@126.com;徐虹,通信作者, 电话: 18959282580, E-mail: hxu@xmu.edu.cn

(本文编辑: 梁德海)