禽脑脊髓炎病毒VR株的致病性研究

王　红，曹　志，韩乃君，郭伟伟，范根成

(青岛易邦生物工程有限公司/动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266114)



禽脑脊髓炎病毒VR株的致病性研究

王红，曹志，韩乃君，郭伟伟，范根成*

(青岛易邦生物工程有限公司/动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266114)

为探索禽脑脊髓炎病毒强毒VR株对SPF鸡的致病性，开展了不同接种途径和不同日龄SPF鸡的致病力试验。不同接种途径致病力试验结果表明，AEV VR株口服后不能引起发病；刺种、肌肉注射途径接种随着日龄增大，发病率降低；脑内注射途径接种可引起试验鸡全部发病。最小致病量试验结果显示，VR株脑内注射攻毒的最小致病量为102.0EID50。不同日龄SPF鸡的致病力试验结果表明，随着试验鸡日龄的增大，其致病力略有差异，日龄越小，发病率越高。结果表明，AEV VR株脑内攻毒70日龄内SPF鸡的发病率为80%及以上，攻毒剂量为104.0EID50。

禽脑脊髓炎病毒VR株；接种途径；日龄；最小致病量；致病性

禽脑脊髓炎(Avian encephalomyelitis,AE)又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)引起的一种病毒性传染病，主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理学特征[1-3]。临床表现为运动失调、头颈震颤和后趾麻痹等神经症状[1]。雏鸡最易感染，发病率一般为20%～60%，病死率10%～25%，甚至更高[3]。成年鸡感染可引起一过性产蛋下降(5%～10%)，但不表现神经症状[1]，严重情况下病毒经血液进入种蛋，使孵化率降低并引起子代雏鸡带毒发病[4-5]。

该病尚无有效的药物治疗，预防主要依靠疫苗免疫接种。美国、德国、法国、西班牙等国家已于20世纪60年代，成功研制出了禽脑脊髓炎弱毒活疫苗[6]及禽脑脊髓炎-鸡痘二联活疫苗[7]，并已商品化生产和销售。国际上疫苗的免疫效果均采用对VR株的攻毒保护率来评估，因此本研究采用不同途径、不同日龄SPF鸡进行AEV VR株的致病力研究，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1禽脑脊髓炎强毒VR株冻干毒种，中国兽医药品监察所提供。

1.1.2SPF鸡胚SPF种蛋,购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，购回后自行孵化至所需日龄。

1.1.3SPF鸡1日龄SPF雏鸡，SPF种蛋购回后,在青岛易邦生物工程有限公司动物房孵化出雏；14日龄～84日龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1VR株毒种的制备及病毒含量测定

1.2.1.1VR株毒种的制备将VR株冻干毒种用灭菌PBS复原后作20倍稀释，经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，37 ℃继续孵育，至16日龄时收获鸡胚脑组织，研磨后加灭菌PBS做1∶4稀释，冻融3次后，4 000 r/min离心30 min后取上清，分装1.0 mL/支，置-70℃保存备用[8]。

1.2.1.2VR株毒种病毒含量测定将VR株毒种用灭菌PBS作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各5枚，0.2 mL/枚，另取5枚同批次SPF鸡胚作对照。37 ℃孵育(48 h内死亡者弃去不计)至16日龄后，剖检观察其病变，统计各稀释度接种感染胚数，按Reed-Muench法计算EID50[8]。

1.2.2对SPF雏鸡不同接种途径的致病性试验用AEV VR株强毒经口服、刺种、肌肉注射、脑内注射4种途径，分别接种1日龄、21日龄SPF雏鸡各10只，104.0EID50/只；另设1日龄、21日龄SPF雏鸡各10只不接种作为对照，分别于负压隔离器中饲养28 d，观察试验鸡的发病情况。

1.2.3最小致病量试验将AEV VR株强毒稀释成每0.1 mL分别含104.0EID50、103.0EID50、102.0EID50、5×101.0EID50，分别脑内注射攻毒42日龄SPF鸡各10只，0.1 mL/只；另设同日龄SPF鸡脑内注射无菌PBS作为对照，0.1 mL/只。分别于负压隔离器中饲养28 d，观察试验鸡的发病情况。

1.2.4对不同日龄SPF鸡的致病性试验用AEV VR株强毒，分别脑内注射14、42、56、70、84日龄SPF鸡各10只，104.0EID50/只；另设14、84日龄SPF鸡各10只不接种作为对照。分别于负压隔离器中饲养28 d，观察试验鸡的发病情况。

2　结果

2.1VR株毒种制备及病毒含量测定结果

将VR株毒种经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，接种后第10日收毒。收获时鸡胚可见典型病变：胚体小，发育不良，皮肤干燥，被毛粗乱，腿细爪曲或外翻，脑有出血点、水肿、脑脊髓软化等。毒种的病毒含量为105.7EID50/0.2 mL。

2.2对SPF雏鸡不同接种途径的致病性试验结果

用AEV VR株病毒(104.0EID50)经4种途径分别接种1日龄和21日龄SPF雏鸡，观察28 d。结果显示，AEV VR株口服试验鸡均未见异常；刺种和肌肉注射1日龄SPF雏鸡均100%发病，21日龄SPF雏鸡均未见异常；脑内注射试验鸡均100%发病。对照组鸡均正常。发病鸡临床主要表现为精神沉郁，羽毛蓬松，反应迟钝，闭眼，缩颈，低头或扭头，喜卧，驱赶时共济失调，站立困难，斜坐在跗部，瘫痪，偶尔见头颈部震颤等(表1)。

表1　对SPF雏鸡不同接种途径的致病性试验结果Table 1　Pathogenic test in SPF chickens by different routes of vaccination

2.3最小致病量试验结果

用不同剂量AEV VR株病毒分别脑内注射攻毒42日龄SPF鸡，观察28 d。结果显示，104.0EID50攻击10/10发病，103.0EID50攻击9/10发病，102.0EID50攻击8/10发病，5×101.0EID50攻击5/10发病。PBS对照鸡10/10正常。发病鸡临床主要表现同2.2(表2)。

表2　最小致病量试验结果Table 2　The minimum amount of pathogenic test

2.4对不同日龄SPF鸡的致病力试验结果

用AEV VR株病毒(104.0EID50)脑内注射不同日龄SPF鸡，观察28 d。结果显示，14日龄SPF鸡发病率为10/10；42日龄～70日龄SPF鸡发病率为8/10～9/10；84日龄SPF鸡发病率为7/10。对照鸡均10/10正常。发病鸡临床主要表现同2.2(表3)。

表3　对不同日龄SPF鸡的致病力试验结果Table 3　Pathogenic test with different ages of SPF chickens

3　讨论

本试验采用AEV VR株(104.0EID50)经4种途径分别接种1日龄和21日龄SPF雏鸡。结果显示，只有脑内注射1日龄、21日龄SPF雏鸡均10/10发病；刺种、肌肉注射对1日龄SPF雏鸡能引起10/10发病，但对21日龄SPF雏鸡不能引起发病；口服均不能引起发病。比较得出脑内注射途径最易感，所以AEV VR株攻毒途径采用脑内注射。本试验结果验证了关于AEV VR株的描述：AEV VR株病毒是通过鸡脑内接种反复传代而获得的鸡胚适应株，这类病毒高度嗜神经。脑内接种(发病率稳定)或非肠道途径，如肌肉或皮下接种(发病率不稳定)均可引起严重的神经症状。除非剂量很高，口服一般不引起感染，也不能水平传播[1]。

试验采用不同剂量AEV VR株，分别脑内注射攻毒42日龄SPF鸡。结果显示，102.0EID50的AEV VR株攻毒能达到80%的临床发病率，因此，AEV VR株的最小致病量定为102.0EID50。Westbury H A等[9]报道称，1日龄～42日龄鸡(AE抗体阴性)，VR株脑内注射(约含102.0EID50)攻毒临床发病情况为：1日龄～28日龄鸡攻毒发病率为5/5，35日龄～42日龄鸡攻毒发病率为4/5。考虑到实际应用中环境温度、稀释液、操作等各种因素对病毒的影响，为保证攻毒结果成立，攻毒剂量定为104.0EID50。

AEV VR株(104.0EID50)脑内注射对不同日龄SPF鸡的致病力随着日龄增大略有下降。日龄越小，发病率越高，临床表现越严重。Westbury H A等的研究表明[10]，35日龄～56日龄试验鸡(没有感染过AEV)，VR株(约含104.0EID50)脑内注射攻毒临床发病情况为：35日龄鸡攻毒发病率为5/5，42日龄～49日龄鸡攻毒发病率为4/5，56日龄鸡攻毒发病率为3/5。因此，本试验结果与国外的研究结果基本一致。

关于试验鸡临床发病判定应该注意：试验鸡脑内注射AEV VR株攻毒潜伏期一般5 d～10 d，观察其临床发病表现差别很大。较严重者临床表现为共济失调、站立困难、斜坐在跗部甚至瘫痪，偶尔可见头颈部震颤，症状比较明显，因此容易判定；较轻者临床表现为低头或扭头、缩脖、喜卧、闭眼、羽毛蓬松、精神沉郁、反应迟钝等，症状不明显，因此不容易判定。所以试验鸡在每日观察时，要与对照鸡进行对比观察，尤其是精神状态和对外界的反应情况，要仔细对比观察并认真记录，统计发病率才能准确。

[1]Saif Y M.禽病学[M].12版.北京：中国农业出版社，2012：497-500.

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[3]张淑霞，杨增岐，季芳，等.禽脑脊髓炎病毒感染雏鸡的病理组织学观察[J].中国兽医杂志，2009，45(11)：26-28.

[4]张淑霞，杨增歧，李金钧，等.禽脑脊髓炎的调查及病毒分离[J].中国兽医学报，2000，20(6)：551-553.

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Study on Pathogenicity of Avian Encephalomyelitis Virus Van Roekel Strain

WANG Hong，CAO Zhi，HAN Nai-jun，GUO Wei-wei，FAN Gen-cheng

(YebioBioengineeringCo.,Ltd.,StateKeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineeringVaccine,Qingdao,Shandong,266114,China)

To study the pathogenicity of avian encephalomyelitis virus Van Roekel (VR) strain in SPF chickens,pathogenicity test was conducted with SPF chickens of various ages by different routes of vaccination.Pathogenicity test in SPF chickens by different routes of administration showed that chickens had no clinical signs after oral route vaccination, and with the growth of the chickens,the incidence rate decreased by wing-web and intramuscular inoculation,however,intracerebral injection led to 100% mortality.The minimum pathogenic dose was 102.0EID50by intracerebral route in the study of minimum amount of pathogenic test.The pathogenicity test with SPF chickens of various ages indicated that the younger the chicken is, the higher the morbidity is.Moreover,all the above serve to prove that the incidence rate of 80% or over 80% was achieved by challenging with virulent AEV VR strain to SPF chickens less than 70 day-old by intracerebral route of inoculation, with the challenge dose of 104.0EID50.

Avian encephalomyelitis virus Van Roekel stain; route of administration;day age;minimum pathogenic dose;pathogenicity

2016-03-11

王红(1977-)，女，山东邹平人，兽医师，学士，主要从事禽用疫苗研究和检验工作。*通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)10-0057-03