猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株E11105 N基因的序列分析与原核表达

张升波，陈绍品，温贵兰，伍昌华，李天珍，李　晨，王开功，文　明，龚新勇

(贵州大学动物科学学院预防兽医实验室，贵州贵阳 550025)



猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株E11105 N基因的序列分析与原核表达

张升波，陈绍品，温贵兰*，伍昌华，李天珍，李晨，王开功，文明，龚新勇

(贵州大学动物科学学院预防兽医实验室，贵州贵阳 550025)

为研究PRRSV N蛋白的结构、功能以及N蛋白在病毒致病中的作用，以临床分离PRRSV毒株E11105为研究对象，采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物，经RT-PCR扩增出N基因片段，利用相关分子生物学软件对N基因序列进行分析；将N基因克隆连接到pCold Ⅰ原核表达载体上，经PCR、双酶切鉴定及序列测定后，得到重组质粒pCold Ⅰ-N，将pCold Ⅰ-N转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达后用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot验证分析。结果显示，分离株E11105 N基因与北美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株Lelystad virus(LV)、中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1、中国代表株CH-1a的核苷酸序列同源性分别为93.3%、34.7%、99.2%、95.4%，氨基酸序列同源性分别为94.4%、15.3%、94.4%、99.2%；系统进化树显示,E11105株N基因与美洲型代表株VR-2332、中国高致病性JXA1毒株的亲缘关系较近；分离株E11105 N基因所编码蛋白不存在跨膜区；二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，分别占20.33%和63.41%；预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明，重组N蛋白主要存在于菌体沉淀中，分子质量约为16.7 ku；Western blot结果显示，带His标签的重组表达蛋白能被His单克隆抗体识别，显色后条带约为16.7 ku，与SDS-PAGE蛋白电泳的条带大小一致。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；N基因扩增；序列分析；原核表达

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)也称猪蓝耳病，是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种传染病[1]。PRRSV既可水平传播，也可通过胎盘感染胎儿，仔猪及成年猪被PRRSV感染后多表现为呼吸困难、肺炎、生长速度减慢，并可能出现其他病毒或细菌的继发性感染[2-3]。目前将PRRSV分为2个基因型，即欧洲型(代表株为LV株)和美洲型(代表株为VR-2332株)[4]。PRRSV是单股正链RNA病毒，其基因组包含至少9个开放阅读框(open reading frame，ORF)，其中ORF1a和ORF1b约占整个基因组全长的2/3，编码14个非结构蛋白，其余基因编码8个病毒结构蛋白[5-6]。核衣壳蛋白N是PRRSV的结构蛋白之一，由ORF7基因编码，为碱性蛋白，N蛋白含有5个～7个抗原决定簇，具有良好的抗原性，是功能最为复杂的蛋白[7-8]。本研究以临床分离的PRRSV毒株E11105为材料，应用基因工程技术成功构建了携带E11105毒株N基因的重组原核表达质粒pCold Ⅰ-N并对其N基因进行序列分析，首次对E11105毒株N基因编码蛋白进行预测分析并实现了E11105毒株N蛋白在大肠埃希菌原核表达系统中的表达。本研究结果为后续进一步研究E11105毒株N蛋白的结构、功能以及PRRSV N蛋白在病毒致病中的作用奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1生物材料猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株E11105，浙江大学方维焕教授惠赠(浙江分离株)；pCold Ⅰ质粒，上海兽医研究所马永志教授惠赠；大肠埃希菌BL21(DE3)、DH5α感受态细胞、Marc145细胞，贵州大学动物科学学院预防兽医实验室保存。

1.1.2所用试剂RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、dNTP，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；RNasin○R核酸酶抑制剂、反转录酶M-MLV，普洛麦格(北京)生物技术有限公司产品；Oligo(dT)15 Primer，天根生化科技(北京)有限公司产品；Primer STAR HS DNA Polymerase、限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、连接酶Solution Ⅰ、质粒DNA抽提试剂盒、Marker DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品；His-tag抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，碧云天生物公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成根据GenBank中已公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因序列进行分析(GenBank登录号：EF112445)，采用Primer Premier 5.0设计1对引物，引物序列为N-EcoRⅠ-pCold Ⅰ-F：CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGC；N-XbaⅠ-pCold Ⅰ-R：GCTCTAGACTATGCTGAG GGTGATGCTG，下划线处分别为EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位点，预期扩增片段长度为372 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2病毒RNA的提取与RT-PCR扩增取成功转染E11105毒株的Marc145细胞，采用RNA提取试剂盒操作方法提取总RNA，并反转录生成cDNA。反转录体系：RNA溶液8 μL，Oligo(dT)152 μL，70 ℃的水浴作用5 min后，取出置于冰上，再加入 5×M-MLV buffer 6 μL，RNasin 1 μL，dNTP 2 μL，M-MLV反转录酶1 μL，补H2O至20 μL。反转录条件：42 ℃ 1 h，75 ℃ 15 min。用反转录生成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为： 5×GC buffer 4 μL，dNTP Mix 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，PrimerStar 0.5 μL，cDNA 2 μL，补H2O至20μL。PCR反应条件为：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s；50 ℃ 5 s；72 ℃ 1 min，共进行35个循环；最后72 ℃ 10 min。反应结束后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.3原核表达载体pCold Ⅰ-N的构建及双酶切鉴定 PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，参照胶回收纯化试剂盒操作方法纯化回收PCR产物。将回收的PCR产物与原核表达载体pCold Ⅰ分别用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，用Solution Ⅰ连接酶16℃连接过夜，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，置于37℃细菌培养箱培养16 h～24 h，挑单个菌落于LB液体培养基中过夜培养，取菌液按照1.2.2进行PCR扩增及电泳检测。菌液PCR鉴定出阳性重组质粒后，用质粒提取试剂盒操作方法提取质粒，并用EcoRⅠ、XbaⅠ进行双酶切，鉴定目的片段与质粒是否成功连接，将初步鉴定为阳性的重组质粒送广州立菲生物公司测序。

1.2.4N基因序列比对分析及生物信息学分析使用DNA Star7.1生物学软件,根据获得的N基因序列片段推导其氨基酸序列，对GenBank已发表的15株PRRSV N基因序列进行比对和分析，参考毒株信息[9-10]见表1，并运用MegAlign软件绘制系统进化树；采用SOPMA在线服务器(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)预测蛋白质二级结构；采用TMHMM Server V.2.0在线服务器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测跨膜结构区；采用DNA Star7.1软件中Protein程序预测B细胞表位参数。

1.2.5重组N蛋白的诱导表达与SDS-PAGE分析 将重组菌按1∶100的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD 600 nm≈0.6，加入IPTG(终浓度为1.0 mmol/L)，于18 ℃振荡培养12 h，取诱导表达的菌液，离心取沉淀，用PBS悬浮于冰上超声破碎处理，超声后的菌体经离心后，分别收集上清和菌体，菌体重新加入PBS悬浮，加入5×SDS上样缓冲液，煮沸5 min～10 min。其他对照组也用同样方法处理，用150 mL/L的SDS-PAGE分析重组蛋白的表达结果。

1.2.6Western blot分析 蛋白样品经150 mL/L SDS-PAGE电泳后，电转印至PVDF膜上，用50 g/L脱脂乳PBST(含0.5 mL/L Tween-20)37 ℃封闭1 h，加入His-tag抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗5次，每次8 min；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1 000稀释)，37 ℃摇床孵育1 h；TBST洗膜5次，每次5 min；二氨基联苯胺(DAB)-H2O2避光显色30 min，去离子水终止反应，分析结果。

2　结果

2.1N基因的扩增

利用提取的总RNA逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出约372 bp的特异性条带(图1)，与预期条带一致。

M.DNA 标准DL 2 000;1,2.N基因的PCR产物

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.PCR products of N gene

图1N基因的RT-PCR结果

Fig.1RT-PCR results of N gene

2.2重组表达载体pCold Ⅰ-N酶切鉴定

提取经菌液PCR鉴定阳性菌液的质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对重组质粒进行双酶切，凝胶电泳检测。结果显示酶切产物呈现两个条带(图2)，一条为目的条带，大小为372 bp；另一条为质粒条带，大小为4 407 bp。结果表明目的片段已成功插入质粒。

M.DNA 标准DL 2 000;1,2.重组质粒pCold Ⅰ-N酶切产物

M.DNA Marker DL 2 000;1,2.Products of recombinant plasmid pCold Ⅰ-N by enzyme digestion

图2重组质粒pCold Ⅰ-N的酶切鉴定结果

Fig.2Enzyme digestion results of recombinant plasmid pCold Ⅰ-N

2.3N基因序列测定结果与分析

将阳性重组质粒送广州立菲生物公司测序。获得E11105毒株N基因的核苷酸系列，长度为372 bp，编码123个氨基酸(图3)。

图3　E11105株N基因测序结果

2.3.1N基因同源性比对分析将本次重组得到的N基因序列和推导的氨基酸序列与GenBank中公布的PRRSV N基因和推导的氨基酸序列进行比对分析。结果显示，分离株E11105 N基因与北美洲型代表株VR-2332(PRU87392)核苷酸序列同源性为93.3%，氨基酸序列同源性为94.4%；而与欧洲型代表株Lelystad virus(M96262)核苷酸序列同源性为34.7%，氨基酸序列同源性仅为15.3%；与中国2006年暴发的高致病性PRRSV代表株JXA1(EF112445)核苷酸序列同源性高达99.2%，氨基酸序列同源性为94.4%；与中国代表株CH-1a(AY032626)核苷酸序列同源性为95.4%，氨基酸序列同源性高达99.2%(图4和图5)。

2.3.2N基因系统进化树分析将分离株E11105与GenBank公布的不同毒株N基因的核苷酸序列采用MegAlign软件绘制系统进化树。由图6可知，以欧洲型代表株Lelystad virus(M96262)与美洲型代表株VR-2332(PRU87392)在进化树上分为两个大支，分离株E11105与美洲型代表株VR-2332(PRU87392)属于同一分支，与中国暴发的高致病性JXA1处于同一小分支，说明本研究毒株E11105与中国的高致病性PRRSV亲缘关系接近。

图4　E11105株N基因核苷酸序列同源性比较

图5　E11105株N基因编码的氨基酸序列同源性比较

图6　E11105株N基因核苷酸序列系统进化树

2.4N基因编码蛋白的生物信息学分析

2.4.1N基因编码蛋白的跨膜结构预测采用TMHMM Server V.2.0在线服务器对N基因编码蛋白的跨膜结构域进行预测和分析(图7)。结果显示，E11105株N基因编码蛋白不具有跨膜区。

2.4.2N基因编码蛋白二级结构预测 在线服务器预测N基因编码蛋白的二级结构(图8)。由图可知，E11105株N基因编码蛋白的二级结构主要包括α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲，所占比例分别为20.33%、4.07%、12.19%和63.41%(表2)。整个结构中无规则卷曲与α-螺旋区域出现较多，而此序列中β-转角和β-折叠所占比例相对较少。

2.4.3N基因编码蛋白B细胞抗原表位预测 采用DNA Star的Protein软件，综合分析预测N基因编码蛋白B细胞表位各参数。Kyte-Doolittle法分析亲水性，Karplus-Schulz法分析柔韧性，Jameson-Wolf法分析抗原指数，Emini法分析氨基酸表面可及性，以高于阈值的氨基酸残基作为候选参考区域。1-75位氨基酸区域有良好的亲水性，抗原性和表面可及性都较高，氨基酸柔性区域分布不均匀，但相对集中。75-123位氨基酸区域亲水性和表面可及性参数较小，58-123位氨基酸区域氨基酸柔性区域分布较均匀，92-102位氨基酸区域抗原性较高(图9)，表明N基因编码蛋白N端肽段各参数优势相对明显。根据对E11105株N基因编码蛋白的B细胞抗原表位的亲水性、抗原指数、柔韧性、氨基酸的表面可及性综合分析，各肽段的优势抗原表位(表3)，预测N蛋白可能存在5个B细胞优势抗原表位，综合各参数预测N蛋白可能存在5个优势表位(aa)，分别为5-15、17-19、32-53、59-62、68-71位氨基酸。

2.5重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果

取超声的诱导菌液上清、未诱导的菌液、超声的诱导沉淀菌体、未超声诱导的菌液，用150 mL/L SDS-PAGE电泳成像(图10)，对结果进行分析。由图10可知，在蛋白分子质量15 ku～20 ku之间出现一条大小约为16.7 ku的特异性蛋白条带，与预期的蛋白大小一致且主要存在于菌体沉淀中，对照样品则未见明显表达。

图7　N基因编码蛋白跨膜结构域预测

图8　N基因编码蛋白二级结构预测

二级结构名Nameofsecondarystructureα-螺旋/%Alphahelixβ-转角/%Betaturnβ-折叠/%Betaextendedstrand无规则卷曲/%IrregularcoilPRRSV-E11105-N20.33(25/123)4.07(5/123)12.1(15/123)63.41(78/123)

图9　N基因编码蛋白B细胞表位参数预测

预测参数Predictionparameters预测结果Predictionresults亲水性Hydrophlicity1-21,30-74,81-85,95-99,105-107,109-113柔韧性Flexibility5-20,32-53,59-62,68-73,77-81,83-88,93-98,107-109,119-121抗原指数Antigenicindex1-19,31-54,58-74,84-88,92-100,106-108,113-116,118-123表面可及性Surfaceprobabilityplots1-19,32-54,58-63,66-71,107-110,122-123合计Total5-15,17-19,32-53,59-62,68-71

M.蛋白分子质量标准; 1～3.超声的诱导菌液上清；4.未诱导的菌液；5～7.超声的诱导沉淀菌体；8.未超声的诱导菌液

M.Protein molecular weight Marker;1-3.The supernatants of ultrasound bacteria induced by IPTG；4.Bacteria without induction by IPTG；5-7.The precipitates of ultrasound bacteria induced by IPTG；8.Induced bacteria without ultrasound

图10重组N蛋白的SDS-PAGE鉴定

Fig.10SDS-PAGE identification of recombinant N protein

2.6Western blot检测结果

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF转移膜上，进行Western blot分析(图11)。由图11可见,PVDF膜出现了与目的蛋白理论值大小一致的条带，约16.7 ku。

M.蛋白分子质量标准;1～3.重组蛋白pCold Ⅰ-N；4.空载体pCold Ⅰ

M.Protein molecular weight Marker;1-3.Recombinant protein pCold Ⅰ-N；4.Empty vector pCold Ⅰ

图11重组N蛋白的Western blot分析

Fig.11Western blot analysis of recombinant N protein

3　讨论

尽管全世界有众多关于PRRSV的研究，但迄今为止PRRS的防控仍然不理想。PRRSV含有多个基因，编码核衣壳蛋白的ORF7基因非常保守，可作为PCR检测的靶基因[11]。ORF7基因编码的核衣壳蛋白N为高保守性的非糖基化核衣壳蛋白，该蛋白在病毒感染的细胞中表达丰富，是病毒粒子中含量最高的蛋白，约占病毒蛋白总量的20%～40%[12]。N蛋白是免疫原性最强的蛋白，能刺激机体产生强烈的免疫应答[13-14]，猪感染PRRSV后,7 d即可检测抗N蛋白抗体，并且针对N蛋白的抗体在体内存活时间较长，以N蛋白作为检测抗原具有较高的敏感性和特异性，是临床诊断与检测方法中的首选[15]。

本研究把从临床分离的毒株E11105 N基因克隆连接到pCold Ⅰ原核表达载体上，并对N基因序列进行了分析。通过序列比对发现，分离株E11105与VR-2332、JXA1、CH-1a的N基因核苷酸序列、推导氨基酸序列同源性极高，系统进化树显示E11105株N基因与VR-2332、JXA1毒株的亲缘关系较近，属于同一遗传进化分支，可以推测E11105分离株接近与美洲型PRRSV；分离株E11105 N基因所编码蛋白不存在跨膜区；二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，分别占20.33%和63.41%；预测该蛋白可能存在5个较为明显的B细胞优势抗原表位，这与张松林等[16]报道相似，但氨基酸区域有一定的差异，这可能是由于不同毒株变异引起的，有待进一步研究。

本研究利用pCold Ⅰ-N重组质粒高效表达出的重组蛋白带有组氨酸标签，可以利用亲和层析技术纯化蛋白，为今后制备标准化的抗原打下基础，也为进一步研究E11105毒株N蛋白的结构、功能以及PRRSV N蛋白在病毒致病中的作用具有重要意义。

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�毒株信息 Table 1The information of

序号№毒株名称StrainnameGenBank登录号GenBankaccessionnumber分离地区Isolatedregion1Lelystadvirus(LV)M96262荷兰Netherlands2VR2332PRU87392美国American3CH-1aAY032626国China4JXA1EF112445中国China5LV4.2.1AY588319欧洲Europe6RespPRRSMLVAF066183美国American7LNEU109502中国China8WUH2EU678352中国China9BJ-4AF331831中国China10SY0608EU144079中国China11GDEU109503中国China12HN-HWFJ797690中国China13HUB2EF112446中国China14JA142AY424271中国China15F1AF030306中国台湾TaiwanChina

Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of N Gene of PRRSV E11105 Strain

ZHANG Sheng-bo,CHEN Shao-pin,WEN Gui-lan,WU Chang-hua,LI Tian-zhen,LI Chen,WANG Kai-gong,WEN Ming,GONG Xin-yong

(LaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicine,CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou,550025,China)

In order to study the N protein structure,function of PRRSV and its role in the viral pathogenesis,we took the isolated PRRSV strain E11105 as the research object and designed a pair of primers by Primer Premier 5.0.Then we amplified N gene by RT-PCR and analyzed N gene sequences by molecular biology related software.We constructed a recombinant vector pCold Ⅰ-N.The recombinant plasmid pCold Ⅰ-N was confirmed by PCR,double enzyme digestion and sequencing,and was transfected intoEscherichiacoliBL21(DE3) competent cells.N protein induced by IPTG was detected and analyzed by SDS-PAGE and Western blot.The results showed that the N gene nucleotide sequence similarities of the isolated E11105 with North American type strain VR-2332,the European type strain Lelystad virus (LV),highly pathogenic PRRSV strain JXA1 in 2006 in China and Chinese strain CH-1a are respectively 93.3%,34.7%,99.2% and 95.4%,and the amino acid sequence similarities are respectively 94.4%,15.3%,94.4%,99.2%.Phylogenetic tree showed that the N gene of E11105 strain and the American type VR-2332,the highly pathogenic JXA1 strain are closely related.There were no transmembrane domains for N gene encoding protein of E11105.The secondary structure is mainly dominated by alpha helix and irregular coil,which account for 20.33% and 63.41%,and the N protein was predicted that might have five B cell dominant epitopes.SDS-PAGE showed that recombinant N protein has a 16.7 ku molecular weight and mainly distributes in the cell precipitate.Western blot results showed that the recombinan N protein has an immune response with His antibody,and the band is about 16.7 ku,which is coincident with the result that analyzed by SDS-PAGE.

PRRSV; N gene amplification; sequence analysis; prokaryotic expression

2016-03-17

国家自然科学基金项目(31460668)；贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2015]2046号)；贵州大学大学生“SRT”计划项目(贵大SRT(2014)121号)；贵州大学“本科教学工程”项目(JKSP2013004)

张升波(1992-)，男(苗族)，贵州务川人，动物医学专业本科生，主要从事预防兽医学研究。*通讯作者

S852.659.6；Q789

A

1007-5038(2016)10-0041-07