小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立

高华峰，赵文华，高　林，杨仕标

(云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650024)



小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立

高华峰，赵文华，高林，杨仕标*

(云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650024)

构建了小反刍兽疫病毒(PPRV) 辅助质粒和微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1 N、 P和L基因，亚克隆至有T7启动子的原核表达载体pGEM3Z构建完成3个辅助质粒，分别命名为pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L，并通过全基因合成构建含PPRV 病毒5′端启动子序列(AGP)、3′ 端启动子序列(GP)、T7转录终止信号、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰转移酶(CAT),获得 PPRV 微型复制子重组质粒 pGEM3Z-CAT。构建完成的微型复制子及辅助质粒在表达 T7 RNA多聚酶(T7 RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通过脂质体法优化4种质粒配比,并将其转染至Vero细胞，通过间接免疫荧光分析CAT的表达情况，荧光显微镜观察到荧光的表达，并通过免疫印迹分析CAT蛋白的表达，表明构建的PPRV微型复制子具有转录和复制功能，这将有助于进一步开展以PPRV反向遗传操作为基础的免疫学及蛋白功能研究。

小反刍兽疫病毒；微型复制子；氯霉素乙酰转移酶

小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副黏病毒科、麻疹病毒属的成员，因主要感染小反刍动物而得名，特别是山羊高度易感。该病主要在非洲及中东地区流行，近年来在我国周边国家频繁发生。2007年我国西藏自治区首次报道该病疫情[1-4]，2013年11月新疆再次暴发该病，由于山羊和绵羊的大范围流动，本病在国内迅速传播，至2014年9月不到1年的时间，全国共有22个省(自治区)256个县暴发疫情，2014年发病毒株与巴基斯坦和塔吉克斯坦流行毒株更一致[5]，国内最新研究表明，基因Ⅱ型也在出现在我国的黑龙江省[6-7]。

PPRV基因组为单股负链无节段RNA，从RNA链的3′端至5′端依次分布着N-P-M-F-H-L 6个基因，分别编码相应的6种结构蛋白，各基因间由一定的基因间序列相间隔，PPRV N75/1弱毒疫苗株的基因组序列由15 948个碱基组成[2-3]。应用反向遗传学现已完成所有麻疹病毒属的病毒拯救，由于反向遗传技术可从cDNA水平进行RNA病毒拯救，因而可以利用突变技术有目的地改变病毒基因组结构，获得有感染性的重组病毒，从而极大地方便了病毒复制、增殖包装以及免疫学的研究。为此，我们首先构建了小反刍兽疫病毒N75/1株的微型复制子，利用T7启动子和表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3构成的表达系统进行病毒转录复制效率研究，以方便将来的小反刍兽疫病毒拯救及免疫学研究。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1生物材料病毒、载体及Vero细胞、MEM培养基、胎牛血清，Gibico公司产品；大肠埃希菌DH5α、原核载体pGEM3Z、表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3、小反刍兽疫病毒N75/1弱毒疫苗株，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存。

1.1.2酶及试剂各种工具酶及核酸提取试剂Trizol，宝生物工程(大连)有限公司产品；去基因组RNA反转录试剂盒，北京天根生物公司产品；阳离子脂质体细胞转染试剂(Lipofectamine 3000)，Invitrogen公司产品；PCR扩增试剂盒及产物回收试剂盒,上海生工生物工程技术服务有限公司产品；常用内切酶，Fermentas公司产品；全基因合成及连接送苏州金唯智公司完成；引物合成及DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.1.3抗体氯霉素乙酰转移酶蛋白单克隆抗体，Santa Cruz公司产品;羊抗鼠FITC标记的IgG二抗，碧云天公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计根据小反刍兽疫病毒N75/1毒株，设计合成如下引物用于目的基因的扩增(表1)。

表1　辅助质粒扩增引物Table 1　Primers for helper plasmid amplification

注：带下划线的斜体大写字母为酶切位点，酶切位点前大写字母核苷酸为保护碱基，“+”和“-”分别代表上游引物和下游引物，N为全长核蛋白序列，P为全长磷酸化蛋白，LF1～LF3为分三段扩增的多聚酶蛋白L序列，CAT为氯霉素乙酰转移酶。

Note:The underlined italic capital letters for restriction enzyme sites and enzyme digestion sites before the uppercase nucleotides to protect the base,"+" and "-" representing upstream primer and downstream primer, N for full-length nucleoprotein sequence,P for full-length phosphorylated protein,LF1-LF3 for three segment amplification polymerase L protein sequence,CAT chloramphenicol acetyl transferase.

1.2.2质粒构建以形成广泛病变的 PPRV感染Vero细胞培养物提取细胞总RNA，用上游特异引物合成cDNA,再分别以引物PCR扩增病毒蛋白N、P、L的编码区，TA克隆到pMD19T载体上，再亚克隆到质粒pGEM3Z,获得质粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L。以上3个质粒中病毒蛋白基因均在T7启动子控制下，PPRV微型复制子通过全基因合成调控序列GP和AGP分别为病毒3′端及5′端109 nt和107 nt调控序列，660 bp的报告基因氯酶素乙酰转移酶CAT，核酶序列在基因组3′端引入Hepatitis delta ribozyme (HdvRZ，88bp)和T7终止子序列的重组质粒，测序验证后命名为pGEM3Z-CAT。

1.2.3转染及蛋白瞬时表达鉴定Vero细胞在6孔板上长至80%～90%单层，用重组痘苗病毒VTF7-3吸附感染(MOI=10)1 h。以Lipofection 2000试剂转染，共转染质粒总量按试剂盒说明书进行。质粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L、pGEM3Z-CAT共转染量之比为30∶10∶5∶1。

1.2.4RT及PCR反应提取出现典型细胞病变的Vero细胞总RNA，20 μL体系，42℃反转录15 min，完成反转录后取1 μL cDNA对Vero细胞mRNA扩增，PCR反应条件均设为：94℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min～3 min，30个循环；72℃ 10 min。反应体系为50 μL，连接T载体测序验证后用于后续的酶切及连接，CAT mRNA的检测取转染后48 h的细胞及对照，消化后提取总RNA，20 μL体系，42℃反转录15 min，完成反转录后取1 μL cDNA对Vero细胞mRNA扩增，PCR反应条件均设为：94℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。反应体系为20 μL。

1.2.5间接免疫荧光(IFA)试验共转染质粒48 h后细胞用0.01 mol/L PBS(pH7.2)冲洗3次：用冰丙酮固定20 min，0.01 mol/L预冷PBS漂洗，5 min 3次；滴加1∶2 000稀释的小反刍兽疫N蛋白单抗为一抗，置于湿盒中，室温孵育60 min，0.01 mol/L预冷PBS漂洗，5 min 3次；滴加1∶50稀释的羊抗鼠FITC标记的IgG为二抗，室温避光放置60 min，0.01 mol/L预冷PBS漂洗，5 min 3次；用荧光显微镜观察。丙酮固定10 min，以小鼠抗CAT抗体为第一抗体，FITC标记羊抗鼠IgG为第二抗体，以未转染的Vero为阴性对照，间接免疫荧光染色检测复制子的包装。

1.2.6Western blot分析蛋白免疫印迹则在转染48 h后，取106个细胞裂解进行SDS-PAGE，转膜后100 g/L脱脂奶封闭过夜，以小鼠抗CAT抗体为第一抗体，FITC标记羊抗鼠IgG为第二抗体，以未转染的Vero为阴性对照，用ECL化学发光试剂显色30 min分析结果。

2　结果

2.1N75/1病毒株辅助质粒酶切鉴定

以形成广泛病变的PPRV感染Vero细胞培养物提取细胞总RNA，用上游特异引物合成cDNA，再分别以病毒反转录产物通过特异引物扩增病毒蛋白N、P、L的编码区，TA克隆到pMD-19T载体上，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测并测序验证后分别用外部及内部酶切位点酶切及连接再亚克隆到原核表达质粒pGEM3Z，获得质粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L。酶切鉴定后得到与预期相符的大小分别为1 578、1 530、6 552、1 018 bp的4个条带(图1)。

2.2微型复制子的构建

如图2，由T7启动子，3′端调控序列GP，氯酶素乙酰转移酶CAT，5′端调控序列AGP，丁肝核酶核心切割序,HdvRZ的自我剪切位点在其5′末端的鸟嘌啉之后的磷酸二脂键，T7终止子构成，通过T7启动子有效转录产生初级转录产物正义链，T7由表达禽痘病毒的重组病毒或稳定表达T7聚合酶的允许细胞产生，共转染辅助质料pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L及产生微型复制子的反基因组，负链复制子形成全长正义复制子，并转录表达氯酶素乙酰转移酶CAT的信使RNA。

A.N基因：M.DNA 标准DL 15 000;1,2.质粒pGEM3Z-N双酶切产物;B.P基因：M.DNA 标准DL 15 000;1,2.质粒pGEM3Z-P双酶切产物;C.L基因：M.DNA 标准DL 10 000;1.质粒pGEM3Z-L双酶切产物;2.质粒pGEM3Z-L

A.N gene：M.DNA Marker DL 15 000;1-2.Double enzyme digestion of plasmid pGEM3Z-N;B.P gene：M.DNA Marker DL 15 000;1-2.Double enzyme digestion of plasmid pGEM3Z-P;C.L gene：M.DNA Marker DL 10 000;1.Double digestion of plasmid pGEM3Z-L;2.Plasmid pGEM3Z-L

图1重组质粒的酶切鉴定

Fig.1Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

图2　N75/1病毒基因组全长文库构建策略及微型复制子转录复制

2.3微型复制子在细胞株中的拯救

Vero细胞在6孔板上长至80%～90%单层，用重组痘苗病毒 VTF7-3吸附感染(MOI=10) 1 h，将构建好的4个质粒，按不同浓度配比转染Vero细胞，质粒pGEM3Z-N、pGEM3Z-P、pGEM3Z-L、pGEM3Z-CAT共转染量之比为最终确定为30∶10∶5∶1。转染后于48 h 通过间接免疫荧光观察CAT在细胞中的表达，在细胞浆中观察到少量细胞表达CAT蛋白，表明该系统能有效起始转录，但表达量相对较低(图3)。

2.4标记蛋白CAT表达分析

Vero细胞在6孔板上长至80%～90%单层，用重组痘苗病毒 VTF7-3吸附感染(MOI=10) 1 h，将构建好的4个质粒按30∶10∶5∶1共转染。采用RT-PCR分析CAT基因48 h mRNA转录水平的表达，提取转染Vero细胞总RNA,弃除基因组RNA后反转录，经PCR分析CAT基因的表达，转染Vero细胞中有大小为275 bp的CAT表达，对照细胞则表达(图4A),转染48 h的细胞收集后以1×106细胞量裂解后，通过蛋白免疫印迹分析CAT的表达，经30 min曝光并显色后能观察到26 ku大小的条带(图4B)。表明小复制子能有效起始标记基因CAT的转录。

A.转染Vero细胞对照；B.小复制子的间接免疫荧光染色

A.Transfected Vero cell control；B.Indirect immunefluorescence staining of minireplicon

图3微型复制子在Vero细胞株中的拯救(100×)

Fig.3Rescue of the minireplicon in Vero cells (100×)

A.PCR;B.Western blot;M.DNA 标准DL 2 000;1.阴性对照;2.未转染Vero细胞;3.转染48 h的Vero细胞;4，5.转染48 h的Vero细胞;6.阴性对照

A.PCR;B.Western blot;M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2.Non transfected Vero cells;3.Transfected Vero cells in 48 h;4,5.Transfected Vero cells in 48 h;6. Negative control

图4标记蛋白CAT mRNA表达蛋白的免疫印迹分析

Fig.4Western blot analysis of CAT mRNA expression

3　讨论

关于核酶与基因组的完整性。基因组的完整性，特别是5′末端和3′末端多出的非病毒核苷酸对病毒的拯救成败和效率有重大影响。本研究为实现从转录水平上控制PPRV基因组的完整性，将HdvRZ的cDNA引入到PPRV株全基因组cDNA的末端。关于重组载体转录的正确终止，研究者做过很多尝试。世界上首次拯救出副黏病毒利用转录3′端引入的单酶切位点来解决这一问题。核酶结构的引入，更使这一难题得到了近乎完美的解决。核酶是一种具有酶活性的RNA，将具有自我剪切功能的核酶cDNA，作为顺式作用元件引入全基因组两端，从转录水平上实现对“基因组完整性”的精确控制，从而提高病毒拯救效率[8-9]。

本研究从两个方面来确保病毒基因组的保真性:①PCR要使用高保真酶。本研究使用的是Invitrogen公司的高保真，保真性良好。②基因组的克隆与拼接对PPRV这种基因组较大的病毒，仍然要采用分段克隆然后拼接全长的方法，步骤烦琐，比较容易引入突变。对于每个节段，都要至少测3个克隆一致，才能确定其序列。考虑到“6碱基原则”在副黏病毒基因组复制中的重要作用[10]，本试验在构建微型基因组时选择的序列全长为660 bp，为该体系的有效运行提供了良好保证，转录载体pGEM-3Z为复制严谨型的低拷贝质粒，可以提高重组质粒的稳定性，减少突变率，同时载体中含有高效的T7启动子以及丁型肝炎病毒的核酶和T7转录终止子，保证转录的高效性和准确性。

在众多的影响病毒拯救的因素中，筛选转染用的细胞系也是至关重要的。最先使用的转染细胞均来源于允许细胞，这样，细胞就能提供病毒复制所需要的受体及转录复制酶，对于早期获得重组病毒，通常采用原核启动子来启动基因的转录，后来逐渐发展到用启动效率较高的真核启动子如CMV启动子启始转录，大大提高了重组效率，但对于基因组较大的病毒，真核启动子并未表现出比T7更高的起始转录效率，因而T7启动子仍广泛应用于病毒拯救；由于细胞并不能提供T7启动子所能识别的原核RNA酶结合位点，因而需要提供附加的T7 RNA聚合酶，最早应用的是表达T7 RNA聚合酶的复制缺陷型痘苗病毒，但由于其毒性较大，被后来的VTF7-3系统替换[10-12]。本研究采用VTF7-3和获得稳定表达T7 RNA聚合酶的Vero细胞，尽量避免接种病毒所带来的干扰。

本研究所构建的小反刍兽疫病毒微型复制子的拯救系统，将为进一步提高小反刍兽疫病毒全基因组感染性克隆的拯救效率奠定了基础。

[1]张喜悦,刘春菊,王志亮,等.小反刍兽疫(PPR)传入我国的风险分析[J].中国动物检疫,2007,24(10):40-42.

[2]Dhar P,Sreenivasa B P,Barrett T,et al.Recent epidemiology of peste des petits ruminants virus (PPRV) [J].Vet Microbiol,2002,88(2):153-159.

[3]Shaila M S,Shamaki D,Forsyth M A,et al.Geographic distribution and epidemiology of peste des petits ruminants viruses[J].Virus Res,1996:43(2):149-153.

[4]Wang Z,Bao J,Wu X,et al.Peste des petits ruminants virus in Tibet,China[J].Emerg Infect Dis,2009,15(2):299-301.

[5]Wu X,Li L,Wang Z,et al.Peste des petits ruminants viruses re-emerging in China,2013-2014[J].Transb Emerg Dis,2015,8(1):24-35.

[6]Wang J,Wang M,Cai X,et al.Peste des petits ruminants virus in Heilongjiang province, China, 2014[J].Emerg Infect Dis,2015,21(4):677-680.

[7]Su W,Xing C,Wu Y，et al.Complete genome sequence of a novel mutant of peste des petits ruminants virus obtained from china[J].Acta Virol,2015,59(1):78-83.

[8]Roberts A,Rose J K.Recovery of negative-strand RNA viruses from plasmid DNAs:a positive approach revitalizes a negative field[J].Virology,1998,247(1):1-6.

[9]Barik S.Control of nonsegmented negative-strand RNA virus replication by siRNA[J].Virus Res,2004,102(1):27-35.

[10]Yunus M,Shaila M S.Establishment of aninvitrotranscription system for peste des petits ruminant virus[J].Virol J,2012,9:302.doi:10.1186/1743-422X-9-302.

[11]Calain P,Curran J,Kolakofsky D,et al.Molecular cloning of natural paramyxovirus copy-back defective interfering RNAs and their expression from DNA[J]. Virology,1992,191(1):62-71.

[12]Ghosh A,Nayak R,Shaila M S.Synthesis of leader RNA and editing of P mRNA during transcription by rinderpest virus[J].Virus Res,1996,41:69-76.

Establishment of aninVitroTranscription System for Peste des Petits Ruminant Virus

GAO Hua-feng，ZHAO Wen-hua，GAO Lin,YANG Shi-biao

(YunnanTropicalandSubtropicalAnimalViralDiseaseLaboratory,Kunming,Yunnan,650024,China)

In order to initiate the type of transcription pathways for PPRV,a PPRV minireplicon was constructed and its expression in transfected cells were studied.Backbone of pGEM3Z was used to clone the coding sequences of three genes of PPRV N,P,and L and finally named pGEM3Z-N,pGEM3Z-P,pGEM3Z-L respectively.The d-ribozyme,PPRV 5′genome promoters,3′antigenome promoters,T7 terminator,chloramphenicol acetyltransferase sequences were synthesized by artificial way and finally named pGEM3Z-CAT.These four plasmids were transfected into the cells by lipofectamine 2000 which infected VTF7-3 with T7 RNA polymerase.The expression of the target CAT protein was analyzed by indirect immune fluorescence and then by Western blot.The results showed that the cotransfection displayed that specific fluorescence can be observed in Vero cells and the protein can be detected by Western blot.The constructed PPRV minireplicon is able to replicate and transcribe,which provides a solid foundation for further PPRV studies by reverse genetics.

Peste-des-petits-ruminants virus;minireplicon;chloramphenicol acetyltransferase

2016-01-10

国家自然科学基金项目(31160499)

高华峰(1973-)，男，云南宣威人，副研究员，主要从事动物病毒学研究。*通讯作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)10-0021-05