非洲紫罗兰转基因过程中的抑菌分析

国会艳 郝爱平 贾园园 李继光 张晓军

摘要：以农杆菌介导法将白桦花发育相关基因Bp1AGL对非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl）进行遗传转化，通过设置单一变量研究转基因过程中的抑菌方法。结果表明，在暗培养60 h，侵染时间为6 min，农杆菌活化菌液OD600 nm为0.5，暗培养覆盖无菌纸膜的条件下，抑菌效果良好，转基因效率更高。

关键词：非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl）；转基因；BplAGL；抑菌

中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1301-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.054

Analysis on the Bacteriostatic Test of the Transgenic Process of African Violet

GUO Hui-yan1， HAO Ai-ping1， JIA Yuan-yuan2， LI Ji-guang1， ZHANG Xiao-jun1

（1. Department of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal College， Mudanjiang 157012， Heilongjiang， China；

2. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：Bp1AGL gene related to floral development from Betula platyphylla was introduced into African violet （Saintpaulia ionantha Wendl） by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. On this basis， the bacteriostatic methods by setting single variable in the transgenic process were studied. The results showed that the dark cultivate time was 60 hours， the infection time was 6 minutes，the OD600 nm value of agrobacterium was 0.5，and covered sterile paper film in the dark cultivation stage， bacteriostatic effect and transgenic efficiency were higher than other methods.

Key words： African violet（Saintpaulia ionantha Wendl）；transgene； BplAGL；bacteriostatic

自1983年世界上第一例转基因烟草问世以来，植物转基因技术发展迅猛。目前，全球试种的转基因植物超过4 500种，种植面积达到5 870 hm2以上，其中大豆、棉花、油菜、番茄、马铃薯、烟草、南瓜、甜瓜等8种转基因作物34个品种实现商品化生产[1，2]。杨郁文等[3]首次将花分生组织决定基因APETALA1转入油菜，并且通过分子检测和性状观察证明了APETALA1基因成功转入并得到了有效表达，转基因油菜植株生长正常，花形、花色与野生型无明显差异，且开花期比未转基因油菜提前近15 d。谭琳等[4]利用DNA直接导入法将含有SARS S1基因的植物表达载体pCS1导入农杆菌LBA4404中，并通过农杆菌介导的叶盘转化法得到12株再生番茄小苗，PCR、Southern杂交检测结果证实，有6株为转基因植株。李司等[5]以胡蘿卜种子的下胚轴为外植体，分别将2种不同外源目的基因导入农杆菌LBA4404进行遗传转化，经PCR、Southern-blot和RT-PCR检测，选取转基因成功并正常转录的T1代植株分别进行有性杂交，获取T1代杂交种子。同年秋季播种长出T2代植株，经检测得到含有2种目的基因且蛋白表达量较高的转基因胡萝卜。杨光等[6]利用相同试验体系对VvAG、VvAP3、VvFLC、VvFUL、VvFT、VvAP2、VvSOC1等7个花发育相关基因进行了亚细胞定位，这些基因在葡萄的花、果实以及营养器官中都有不同程度的表达。丁燕等[7]用RT-PCR法在柿花中扩增得到1个343 bp的片段，再利用RACE法分别获得3′端1 096 bp和5′端411 bp的目的片段，拼接后获得1 193 bp全长基因，命名为DkMADS1，DkMADS1基因在柿萼片、花瓣、子房中均表达，而在叶片中不表达，该基因在花器官中表达，推测其与花发育有关。

非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl），株高一般为15～30 cm，植株表面布满绒毛。叶片基生，长圆状心形或卵圆形，长6～7 cm，肉质，全缘，先端钝。花单生或聚生，花径2～3.5 cm，二唇状，唇2裂，下唇3裂，裂片椭圆形，蒴果有毛[8]。东北林业大学林木育种实验室构建了白桦花期时序消减文库，确定了一些有价值的EST序列，克隆了若干有价值的基因，BplAGL即是其中之一[9]。BplAGL属于AG亚家族的一员，BplAGL长度为1 179 bp，其中编码区为723 bp，编码240个氨基酸。由24～74位共51个氨基酸构成MADS-box，由89～188位共100个氨基酸构成K-box[10]。本试验采用农杆菌介导法将BplAGL基因进行转入非洲紫罗兰中，设置单一变量研究试验过程中的抑菌方法，为转基因试验做基础准备工作。

1 材料与方法

1.1 材料

非洲紫罗兰组培苗，组培室培养。LBA4404工程菌，-80 ℃保存。MS液体和固体培养基，1/2MS液体和固体培养基。LB液体和固体培养基。卡那霉素、头孢霉素、6-BA、NAA。芽诱导培养基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA。生根培养基1/2MS+1.0 mg/L NAA。

1.2 方法

1.2.1 暗培养时间筛选 选择生长旺盛，14～15片真叶期的非洲紫罗兰上部叶片作为转化材料。剪掉叶片边缘，将叶片剪成小块（0.5 cm×0.5 cm）。将叶片转入到农杆菌菌液中浸染6 min，轻轻搅动菌液，使叶盘和菌液充分接触。取出叶片用无菌水洗3次，每次30 s，用灭菌的滤纸吸干。将叶面展开，正面朝上，接种在MS固体培养基上，使伤口处贴在培养基表面，加无菌纸膜覆盖在叶片上。重复以上步骤共做4组，将4组培养皿包好，分别放于恒温箱中23 ℃暗培养48、60、72、84 h。在芽诱导培养基中加入头孢（终浓度为600 mg/L），卡那霉素（终浓度为50 mg/L），把暗培养平板上的叶片转接到光培养基上，将伤口处贴在培养基表面，正面朝上。将培养皿用双层封口膜封好，置于光照培养箱中培养（28 ℃，光照培养周期16 h/8 h），观察所培养植物组织是否有农杆菌生长。

1.2.2 浸染时间筛选 将切好的叶盘外植体放入到农杆菌菌液中分别浸染5、6、7、8 min，轻轻晃动菌液，使叶盘和菌液充分接触，暗培养时间均为60 h，其他步骤同上。

1.2.3 菌液OD值选择 将叶片转入到OD600 nm分别为0.4、0.5、0.6、0.7的4组农杆菌菌液中分别浸染6 min，轻轻搅动菌液，使叶盘和菌液充分接触。暗培养时间均为60 h，其他步骤同上。

1.2.4 无菌纸膜的覆盖与否 农杆菌浸染完毕后，一组将无菌纸膜覆盖在叶片上，另一组不覆盖无菌纸膜。暗培养时间均为60 h，其他步骤同上。

2 结果与分析

2.1 暗培养时间的确定

暗培养时间过长会使农杆菌过度生长使植物组织受到毒害而死亡；暗培养时间过短，外源基因不能充分地进入受体植株，转化率会大大降低。因此，农杆菌与外植体的共培养时间是整个转化过程中关键的一个环节。从图1可以看出，在48 h和60 h的暗培养条件下，非洲紫罗兰叶片周围无农杆菌生长，说明抑菌效果较理想；在72 h和84 h的暗培养条件下，叶片周围布满了农杆菌，说明抑菌效果很差。因此，暗培养时间选择为60 h，因为在没有农杆菌生长的情况下，暗培养时间越长，农杆菌与被侵染植株共培养时间越长，外源基因进入受体植株的几率越大，转化率也就越高。

2.2 浸染时间的确定

农杆菌浸染时间是影响遗传转化率的重要因子。从图2可以看出，浸染时间为5、6 min时非洲紫罗兰叶片周围无农杆菌生长；浸染时间为7、8 min时叶片周围布满农杆菌，说明浸染时间5～6 min抑菌效果较好，确定最佳浸染时间为6 min，因为在不长农杆菌的情况下浸染时间越长转基因效率越高。

2.3 菌液OD600 nm的确定

合适的菌液浓度有助于提高转化效率。菌液浓度太低，接种的叶片伤口面的农杆菌数量太少，转化率低；菌液浓度过高，常导致农杆菌繁殖过度，对植物组织产生毒害，同样降低转化效率。从图3可以看出，菌液OD600 nm在0.4和0.5时，非洲紫罗兰叶片周围无农杆菌生长；菌液OD600 nm在0.6和0.7时，叶片周围布满农杆菌，所以确定浸染时菌液最佳OD600 nm为0.5，因为在叶片周围没有农杆菌生长的情况下，OD600 nm越高转化率越高。

2.4 无菌纸膜的覆盖

农杆菌是好氧型细菌，控制其与氧气的接触可以抑制农杆菌的生长。图4（A）中覆盖无菌纸膜的非洲紫罗兰叶片周围无农杆菌生长；而未覆盖无菌纸膜（B）的叶片周围布满农杆菌，结果表明覆盖无菌纸膜对农杆菌的生长起到一定的抑制作用。

3 小结与讨论

本试验通过设置单一变量的方法，研究非洲紫罗兰转基因过程中农杆菌的抑制情况。通过试验，初步建立了转基因过程中较好的抑制农杆菌生长的条件：暗培养时间为60 h，浸染时间6 min，农杆菌菌液最佳OD600 nm为0.5，转入暗培养时覆盖无菌纸膜。

谢秀祯等[11]通过对根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化研究得到，农杆菌菌液OD600 nm超过0.55后，不仅BplAGL基因的瞬时表达率有所降低，而且暗培养后再进行光培养外植体周围被农杆菌包围，最后褐化死亡。暗培养时间必须超过16 h，但如果暗培养时间过长，会因为农杆菌过度生长导致植物细胞受到毒害而死亡。由此看来，农杆菌介导法转基因过程中的抑制农杆菌过度生长试验直接关系到转基因工作的成败，所以本试验的研究能够为下一步BplAGL基因对非洲紫罗兰的遗传轉化提供一定的参考。

参考文献：

[1] 王智琴，王 捷，蔡磊明.转基因植物食品的安全性概况[J].毒理学杂志，2005，19（S1）：325.

[2] 陈业坚，张增勤，吴其褒.Bt基因在农业上的应用及其生物安全性[J].上海农业科技，2005（2）：29-30.

[3] 杨郁文，张保龙，倪万潮，等.花分生组织决定基因APETALA1转化油菜[J].江苏农业学报，2007，23（6）：564-567.

[4] 谭 琳，康由发.SARS S1基因对番茄的遗传转化与转基因番茄植株的获得[J].生物技术通报，2010（10）：131-134.

[5] 李 司，陈年来，李 霞，等.有性杂交获得同时表达两种外源基因的转基因胡萝卜的研究[J].甘肃农业大学学报，2006，41（5）：40-44.

[6] 杨 光，曹 雪，房经贵，等.葡萄花发育基因的亚细胞定位和表达分析[J].中国农业科学，2011，44（3）：641-650.

[7] 丁 燕，韩振海，许雪峰，等.柿花发育相关的MADS-box基因克隆与表达[J].园艺学报，2007，34（1）：39-42.

[8] 陆 帅，董永辉，陈 佳.非洲紫罗兰形态特征及繁殖技术[J].现代农村科技，2009，43（6）：39-40.

[9] 杨传平，魏继承，李同华，等.实时定量PCR法分析白桦中一花发育相关基因BpHEN的时序表达[J]. 东北林业大学学报，2006，34（1）：1-6.

[10] LEMMETYINEN J， HASSINEN M， ELO A， et al. Functional characterization of SEPALLATA3 and AGAMOUS orthologues in silver birch [J].Physiol Plant，2004，121（1）：149-162.

[11] 谢秀祯，林俏慧，郭成栓，等.根癌农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化[J].华南理工大学学报，2006，34（5）：43-47，52.