不同逆境对葡萄酒相关酵母生长特性的影响

王凤梅 马利兵

摘要：為了探究葡萄酒相关酵母对不同逆境的耐受性，从内蒙古西部酿酒葡萄产区分离到4株葡萄酒酵母，分别为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）及克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）。采用杜氏小管发酵法测试这4株酵母对不同逆境（低pH、高酒精度、高浓度SO2、高浓度葡萄糖及高浓度盐）的耐受性。结果表明，葡萄汁有孢汉逊酵母耐低pH能力、耐高SO2能力与耐高盐能力最弱；酿酒酵母耐酒精能力强，耐高糖能力最弱；东方伊萨酵母耐高盐能力弱，耐SO2能力最强；克鲁维毕赤酵母耐酒精能力与耐高盐能力最强。

关键词：葡萄酒；酵母；发酵条件；耐受性；逆境

中图分类号：TS261.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1264-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.044

Effects of Different Stresses on the Growth Characteristics of Wine-related Yeasts

WANG Feng-mei1，MA Li-bing2

（1. Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014030， Inner Mongolia，China；2. School of Mathematics， Physics and Biological Engineering， Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010， Inner Mongolia，China）

Abstract：In order to test the resistance of wine-related yeasts on different types of stresses， four strains of wine-related yeasts（Hanseniaspora uvarum，Saccharomyces cerevisiae，Issatchenkia orientalis and Pichia kluyveri），isolated from wine grape producing area in the western district of Inner Mongolia， were used as materials. Durham tube fermentation were used to test their resistance on different types of stresses （low pH value，high alcohol concentration， high SO2 concentration， high glucose concentration and high salt concentration）. The results showed that Hanseniaspora uvarum had the lowest resistance on low pH value， high SO2 concentration and high salt concentration. Saccharomyces cerevisiae had high resistance on high alcohol concentration， however， had the lowest resistance on high glucose concentration. Issatchenkia orientalis had low resistance on high salt concentration， however， had the highest resistance on high SO2 concentration. Pichia kluyveri had the highest resistance on both high alcohol concentration and high salt concentration.

Key words： wine； yeast； fermentation conditions； resistence； stress

目前，中国葡萄酒生产菌种大部分依赖进口，单一酿酒酵母菌种的纯种发酵使得葡萄酒失去了其特有的香气和风味。如果用天然酿酒酵母接种发酵或者与其他非酿酒酵母菌种混合进行发酵，就可以生产出具有地区特色的葡萄酒[1，2]。非酿酒酵母在葡萄酒生产中不能完全发酵，产酒精的能力也稍差，但在葡萄酒的酒体结构、香气及地区特色等方面却能起到积极作用[3]。因此，充分利用各类酵母的特点和优势，有效控制败坏性酵母的负面影响，会使葡萄酒具有更加复杂的口感和香气，也可以改善单一菌种带来的不良影响[4，5]。本研究对内蒙古西部地区分离到的4株葡萄酒相关酵母的低pH耐受性、酒精耐受性、SO2耐受性，高糖耐受性、高盐耐受性进行研究，旨在为混合接种不同酵母的葡萄酒发酵工艺控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基

YPD培养基：酵母浸粉1%（m/V，g/mL），蛋白胨2%（m/V），葡萄糖2%（m/V，g/mL）[6]。

1.2 试验菌株

内蒙古西部酿酒葡萄产区通过分离鉴定得到的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）及克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）[7]。

1.3 菌种活化、扩大培养及接种

将保藏的酿酒酵母菌株分别接种于YPD液体培养基中，于28 ℃下培养48 h。随后，将活化后的菌种按5%的接种量接种于已装有100 mL YPD液体培养基的三角瓶中，28 ℃、72 r/min摇床中培养72 h。利用血球计数板对扩大培养的菌种进行计数（表1）。

1.4 菌种耐受性测试

1.4.1 低pH耐受性测试 将5 mL灭菌后的YPD液体培养基加入带有杜氏发酵管的试管中，将pH分别调整到2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，按表1所示的接种量分别接种酵母，3次重复，25 ℃下培养3 d，根据产气量确定酵母菌生长情况。

1.4.2 酒精耐受性测试 将5 mL灭菌后的YPD液体培养基加入带有杜氏发酵管的试管中，加入95%的乙醇，将乙醇体积分数分别调整为10%、12%、14%和16%，按表1所示的接种量分别接种酵母，3次重复，25 ℃下培养4 d，根据产气量确定酵母菌生长情况。

1.4.3 SO2耐受性测试 分别将5 mL灭菌后的YPD液体培养基加入带有杜氏发酵管的试管中，加入6%Na2SO3，将SO2浓度分别调整为100、150、200及250 mg/L，按表1所示的接种量分别接种酵母，3次重复，25 ℃下培养3 d，根据产气量确定酵母菌生长情况。

1.4.4 高糖耐受性测试 将5 mL灭菌后的YPD液体培养基加入带有杜氏发酵管的试管中，加入葡萄糖，使其浓度分别为30%、40%、50%和60%（m/m），按表1所示的接种量分别接种酵母，3次重复，25 ℃下培养3 d，根据产气量确定酵母菌生长情况。

1.4.5 高盐耐受性测试 将5 mL灭菌后的YPD液体培养基加入带有杜氏发酵管的试管中，加入NaCl，使其浓度分别为8%、10%、12%、14%和16%（m/m），按表1所示的接种量分别接种酵母，3次重复，25 ℃下培养3 d，根据产气量确定酵母菌生长情况。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株对低pH的耐受性

酵母菌在酸性条件下，发酵能力最强，最适pH为4.5～5.5。在pH很低的条件下，酵母菌生长受到抑制，并生成挥发酸[8]。由图1可知，在pH为4.0～6.0时，所有供试菌株均能旺盛生长；而在pH为3.0时，其生长受到抑制，葡萄汁有孢汉逊酵母最低只能耐受pH为4.0的环境，pH为3.0时不能生长，耐受能力最弱。

2.2 酵母菌株对酒精的耐受性

过高的酒精浓度对酵母有毒性，会抑制细胞的生长及发酵活性。所以，酵母的发酵能力在很大程度上取决于其自身对酒精耐受力的大小[9]。由图2可知，随着酒精度的增高，酵母菌的生长繁殖受到抑制，酒精度越高，酵母菌的生长繁殖越弱。在酒精度为10%～14%时，各菌株均能生长，16%时，葡萄汁有孢汉逊酵母和东方伊萨酵母受到抑制不能生长，酿酒酵母和克鲁维毕赤酵母虽受到抑制，但均能生长。

2.3 酵母菌株对高SO2的耐受性

在葡萄酒生产过程中，葡萄质量好的情况下，SO2使用量在30～100 mg/L；在葡萄质量相对较差的情况下，使用量不超过80～150 mg/L[3]。在葡萄酒标准中，SO2的含量不能超过250 mg/L[10]。因此，葡萄酒酿造用酵母菌株要求有较高的耐SO2能力。由图3可知，所有供试菌株均能耐受200 mg/L的SO2。东方伊萨酵母的耐SO2能力最强，能耐受250 mg/L的SO2。

2.4 酵母菌株对高糖的耐受性

糖的浓度影响酵母的生长和发酵。含糖量在12%～18%的葡萄汁发酵最为迅速，随着糖浓度的升高，发酵能力逐渐受到抑制。由图4可知，所有供试菌株均可耐受50%的葡萄糖，但当葡萄糖浓度达到60%时，酿酒酵母不能生长。糖含量的变化对克鲁维毕赤酵母的生长状态没有影响。

2.5 酵母菌株对高盐的耐受性

不同类型微生物对渗透压变化的适应能力不同，大多数微生物在1%～3%的NaCl浓度范围内可正常生长，10%～15%的NaCl浓度能抑制大部分微生物的生长[11]。由图5可知，NaCl浓度在8%～10%时，所有供试菌株生长状态良好，克鲁维毕赤酵母能耐受16%的盐含量，耐受能力最强。盐含量对酿酒酵母的生长状态没有影响。

3 小结与讨论

在葡萄酒发酵过程中，如果能够充分利用非酿酒酵母的优点及其与酿酒酵母间有益的相互作用，能酿造出风味复杂、风格独特的葡萄酒。据报道[12]，葡萄汁有孢汉逊酵母可以通过代谢和自溶来提高葡萄酒的香气，并且有非常好的产酯能力，参与复杂新鲜的风味物质的形成。葡萄汁有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤酵母有葡萄糖苷酶活性，其中葡萄汁有孢汉逊酵母比酿酒酵母具有更强的产酶能力，尤其在发酵早期，这些非酿酒酵母对葡萄浆中的酶反应有积极的贡献。东方伊萨酵母有较好的降解苹果酸的能力，对改善葡萄酒的风味也有积极的作用。

在葡萄酒生产中，葡萄酒相关酵母的生长繁殖受到很多因素的影响，如酒精度、SO2添加量、营养物状况及葡萄园的地理位置和气候等。只有控制和利用好这些条件，酵母在葡萄酒中生产中的积极作用才能充分展现。葡萄酒在发酵过程中，酵母不可避免地会受到各种胁迫条件的影响。而当胁迫条件超过细胞的极限生理功能时，便会对细胞的生存和发酵过程产生负面影响[13，14]。因此，为了避免发酵过程发生阻遏或迟滞现象，要求酵母必须具备足够的胁迫应答能力来抵御胁迫条件所造成的影响[15，16]。酵母抵御不良环境的能力与发酵过程能否顺利进行和生产效率的高低密切相关。

本研究对分离到的葡萄酒相关酵母的耐受性进行了测试，结果表明，在所测试的4个酵母菌种中，葡萄汁有孢汉逊酵母耐低pH能力、耐SO2能力与耐高盐能力最弱；酿酒酵母耐酒精能力强，耐高糖能力最弱；东方伊萨酵母耐高盐能力弱，耐SO2能力最强；克鲁维毕赤酵母耐酒精能力与耐高盐能力最强。葡萄酒相关酵母的耐受性研究可为葡萄酒混合接种酵母的發酵工艺研究提供依据。

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