猪流行性腹泻病毒湖北株的分离鉴定及其s1基因进化分析

桂锐 郭锐 田永祥 李文浩 蔡行 段正赢 杨克礼 刘泽文 袁芳艳 刘威 邢崔昱 周丹娜

摘要：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是猪的肠道传染病病原，主要引起仔猪呕吐、腹泻和脱水，对一周龄内的哺乳仔猪危害最为严重，死亡率可达50%～100%。利用Vero86细胞从湖北某猪场腹泻仔猪小肠病料中分离到一株病毒，经RT-PCR检测、序列比对后确定其为PEDV，命名为HB201503株。设计PEDV s1基因的全长扩增引物，获得该株病毒的s1基因全长序列并进行了进化分析，结果表明该毒株与近年来在GenBank 登陆的PEDV s1基因核苷酸序列相似性在91.4%～99.2%，与疫苗株CV777相似性较低，仅为91.8%。通过s1基因进化树分析表明HB201503以及近几年国内分离毒株主要集中在第 I 个亚群，且HB201503株与KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江苏）同源性较高。此外，s1蛋白氨基酸序列比对显示，HB201503与近几年分离毒株及疫苗株CV777均在 55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸的缺失或替换，而且HB201503株与CV777及近几年分离毒株相比，还在270-283位氨基酸上出现了1个氨基酸的缺失和10个氨基酸的替换。

关键词：猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）；分离鉴定；s1基因；进化分析

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1506-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.036

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、接触性、高度传染性消化道疾病，主要症状为呕吐、水样腹泻和脱水[1]。各日龄的猪均易感染，其中以哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率最高，尤其以哺乳仔猪受害最为严重[2]。20世纪90年代后期，中国开始大面积使用传染性胃肠炎和流行性腹泻二联苗进行免疫，取得了很好的效果。然而最近几年，猪场在广泛应用PED灭活疫苗和弱毒疫苗的同时，仔猪流行性腹泻不断发生，甚至呈局部暴发流行，这提示可能PEDV发生了变异[3]。对中国最近几年流行性腹泻病毒进化发育分析表明，近年来大规模暴发流行性腹泻的原因可能是流行性腹泻病毒的s基因发生了变异[4]。PEDV的S蛋白可分为S1（1aa-735aa）区和S2（736aa-1383aa）区，其中S1区包含多个病毒主要中和表位和受体结合域，与病毒抗原性和吸附入侵密切相关[5]。因此对PEDV的分离鉴定及s1基因的进化分析对PEDV的防控具有重要意义。本研究从湖北某暴发仔猪腹泻的猪场分离到一株PEDV并命名为HB201503，并对其s1基因进行了克隆测序。将测序结果与最近几年NCBI登陆的PEDV毒株及疫苗株CV777的s1基因核苷酸序列进行了进化分析，旨在为猪流行性腹泻的防控及免疫机理的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α感受态细胞购至康为世纪科技生物有限公司；pET-30A（+）载体、PEDV检测引物参照文献[6]合成；Vero 86细胞由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医团队保存。

1.2 主要试剂

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒购自康宁生命科学有限公司，One-step RT-PCR Super Mix购自北京全式金生物科技有限公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自康为世纪科技生物有限公司，同源重组酶购自南京唯赞生物科技有限公司，BamH I和Hind Ⅲ快切酶均购自TaKaRa公司，胰蛋白示磷酸盐肉汤（Tryptose Phosphate Broth）购自上海浩然生物技术有限公司，氨苄青霉素（Amp）、链霉素（Kan）、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶均购自Invitrogen公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养 采用DMEM培养基（100 U/mL氨苄青霉素，100 μg/mL链霉素，5%FBS）对Vero 86细胞进行培养，培养条件为37 ℃，5%CO2。

1.3.2 病毒分离 采集湖北某猪场腹泻仔猪小肠及内容物加入5倍体积的生理盐水后进行组织匀浆并用0.22 μm微孔滤膜过滤后参照文献[7]中的PEDV分离方法进行病毒分离，具体为：将长满单层Vero 86细胞的6孔板利用PBS缓冲液（不含镁离子和钙离子）洗涤两遍后每孔加入500 μL处理好的病毒悬液，37 ℃、5%CO2条件下孵育30 min，每孔中加入2 mL的DMEM（100 U/mL氨苄青霉素，100 μg/mL链霉素，0.3%TPB）及10 μg/mL的胰酶2 mL。當80%以上细胞出现细胞病变时反复冻融收集病毒悬液。将病毒悬液继续按上述方法接种于Vero上，连续传代3次后对出现细胞病变的阳性孔进行PCR检测。

1.3.3 引物设计 根据GenBank 上近几年登陆的PEDV毒株的基因序列，利用DNAman比对序列后在s1基因序列两边的保守区域利用Primer 5.0设计了一对扩增s1基因序列全长的同源重组引物。引物序列为：上游引物F：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCTCTAATCATTTGGTCAACGTA-3′，下游引物 R：5′-CTCGAGTGCGGCAAGCTTCATTACAAACATA

TGTAACG-3'；检测引物序列为：上游P1：5′-TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′，下游P2：5′-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3′。

1.3.4 RNA 提取 对采集的疑似感染PEDV病料加入5倍体积的生理盐水后进行组织匀浆并反复冻融3次，然后取上清按照说明书进行RNA提取。对于传代3次后且出现细胞病变的细胞，利用移液器将其悬浮后反复冻融3次，离心取上清后按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒说明书提取RNA。

1.3.5 s1基因扩增 以提取的RNA为模板利用全式金One-step RT-PCR Super Mix对s1基因进行扩增。具体反应体系如下：RNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL，2×One-step Reaction Mix 25 μL，One-step Enzyme Mix 1 μL，RNase-free water 17 μL。一步法反应条件如下：45 ℃反转录30 min；94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。检测引物扩增体系与s1基因全长扩增体系一样；反应条件为退火温度55 ℃，延伸时间60 s，其余条件与s1基因全长扩增条件一致。反应结束后取5 μL PCR产物进行琼脂糖电泳检测，其余产物用于胶回收。

1.3.6 s1基因克隆 依照胶回收试剂盒说明书对扩增s1片段进行回收，参照Clone Express II one step kit 说明书将s1片段连接到pET-30A（+）载体上，然后将重组质粒转化到DH5α并挑取单菌落进行扩大培养并抽提质粒进行酶切鉴定，对阳性的重组质粒进行测序。

1.3.7 s1基因序列分析 将测序结果利用DNAman生物软件进行拼接后，再利用DNAStar软件对HB201503毒株的s1核酸序列与近几年国内外流行的PEDV毒株（表1）和疫苗株CV777的s1核酸序列进行序列分析。利用MEGA6.0对s1核酸序列做系统进化分析。最后根据进化树结果选择代表性毒株对其s1基因氨基酸推导序列进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

将连续传代3次后出现细胞病变的细胞毒样品收集，提取RNA后，利用PEDV检测引物对样品进行检测，RT-PCR电泳结果（图1）显示样品可扩增到663 bp大小的目标片段，即分离得到一株PEDV，命名为HB201503。

2.2 s1基因克隆

以PEDV阳性细胞毒中提取的RNA为模板，利用设计的s1基因全长引物进行RT-PCR扩增，结果出现2.4 kb左右的目的条带（图2）。将产物回收用同源重组克隆至pET-30A（+）载体上，提取质粒，用BamH I和Hind Ⅲ做双酶切鉴定，电泳结果（图3）显示分别在2.4 kb和5.2 kb左右出现条带。

2.3 s1基因序列分析

将s1基因测序结果拼接后与疫苗毒株CV777及近几年在GenBank上登陸的部分PEDV毒株进行比较分析，发现HB201503与其他毒株s1基因相似性在91.4%～99.2%，其中HB201503与KM406183（2014）相似性最高，为99.2%，与日本毒株AB548624（2010）相似性最低，为91.4%，与经典毒株CV777相似性较低，为91.8%（图4）。

2.4 s1基因进化分析

将HB201503株的s1核苷酸序列与表1中列举的核苷酸序列以MEGA6.0软件中的最大似然法构建系统进化树（图5），结果显示PEDV主要被分为两个亚群。HB201503位于第I个亚群，与KM406183（2014，四川）和KM609206（2015，江苏）亲源关系较近。国内外近几年在NCBI登陆的毒株主要集中在第I个亚群，而疫苗毒株CV777在第II个亚群。

2.5 S1蛋白氨基酸序列分析

依据上述构建的系统发育树，选取JQ979291、KF177258、KJ646591、KM189366、CV777等各分支的代表序列，推导其S1蛋白的氨基酸序列并进行蛋白质序列比对，结果（图6）显示其变异位置主要发生在55-74、157-163、270-283这三个位置。CV777与HB201503及近几年分离的其他毒株在55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸替换或缺失。HB201503与CV777及近几年分离的其他毒株比较，还在270-283位氨基酸出现了1个氨基酸缺失和10个氨基酸的替换。

3 小结与讨论

国内目前应用于防控PED的疫苗主要是通过将CV777毒株在Vero细胞上传代125代后获得了CV777弱毒株后，在此基础上研发而成的弱毒苗[8]。但近年来国内出现在免疫疫苗后仍然暴发PED的情况，这提示毒株有发生变异的可能。纤突蛋白基因（s）是PEDV结构蛋白中最大的基因，是诱导机体产生免疫性中和抗体的主要免疫蛋白基因[9]，其中S蛋白的S1亚基包含了PEDV主要的中和抗原位点[10]。

本研究通过对HB201503、CV777以及近几年在NCBI上登陆的PEDV s1基因序列进行比较分析，发现近几年的分离株包括HB201503与疫苗株的s1核苷酸序列相似性均较低，这提示毒株发生了一定程度上的变异。从进化树分析结果来看，国内近几年分离到的毒株与美国、韩国等国家近年分离到的毒株被类聚到一个亚群，而这些国家近年来都暴发流行过PED，提示毒株的变异可能造成了病毒毒力的改变或抗原性的改变。本研究根据s1基因系统进化树，将HB201503、CV777及其他一些具有代表性的毒株的s1基因推导氨基酸序列做分析比对，发现CV777与HB201503及近几年分离的其他毒株在55-74、157-163位氨基酸出现了连续4个以上氨基酸替换或缺失，而HB201503与CV777及近几年分离的其他毒株比较，还在270-283位氨基酸出现了1个氨基酸的缺失和10个氨基酸的替换。目前相关研究证明S1蛋白氨基酸在248-280区域是一个能和PEDV颗粒具有高亲和力的表位序列[10]。它出现连续氨基酸的替换可能是导致免疫失败的一个原因。与疫苗株CV777相比，近年来在NCBI登陆的其他毒株S1蛋白氨基酸序列在55-74出现连续4个氨基酸缺失、在157-163位点出现连续5个氨基酸替换对PEDV在生物学意义上有何影响，还有待进一步研究。

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