低温胁迫对矮牵牛H株系花青素、游离脯氨酸及可溶性糖含量的影响

宁露云 包满珠 张蔚

摘要： 以矮牵牛[Petunia hybrida（J. D. Hooker）Vilmorin]H株系为试验材料， 利用人工气候箱进行低温胁迫试验， 调查低温胁迫对矮牵牛叶片中花青素和渗透调节物质游离脯氨酸、可溶性糖含量的影响。结果表明， 花青素在低温处理前期2 h和中期24 h时相对含量变化较对照无显著性差异， 当胁迫增至120 h，其相对含量显著提高；游离脯氨酸含量在低温处理前期2 h时含量变化较对照无明显变化，而在中期24 h达到峰值，此后表现为下降趋势；可溶性糖含量在低温处理前期2 h时含量较对照有明显提高，此后含量略微上升，直至后期120 h一直保持在这一较高水平。研究表明，矮牵牛可能通过积累花青素、渗透调节物质来提高植株的抗寒能力，从而抵御低温胁迫。

关键词： 矮牵牛[Petunia hybrida（J. D. Hooker）Vilmorin]；低温胁迫；花青素；渗透调节物质

中图分类号：S681.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1500-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.034

逆境是植物生长的主要限制因子，植物遭受逆境后，轻则减产或降低观赏价值，重则植株死亡，因而在很大程度上限制了植物的栽培地域扩大和全程观赏时间。矮牵牛[Petunia hybrida（J. D. Hooker）Vilmorin]被誉为“世界花坛花卉之王”，是重要的园林观赏植物，性喜温暖和阳光充足的环境，不耐霜冻，怕雨涝。它的生长适温为13～18 ℃，冬季温度要求在4～10 ℃，如低于4 ℃，植株生长停止，这种不耐寒的生物学习性极大地制约了其在园林中的应用。在前期研究中，课题组对收集、保存以及创制的矮牵牛种质进行了田间自然霜冻和人工气候箱冷冻筛选，从中获得了较为耐寒的矮牵牛株系（代号H），并利用低温胁迫下H株系的表达谱芯片筛选出了大量的差异表达基因[1]。对这些差异基因进行分析后，发现和花青素代谢途径相关的一些基因在低温胁迫处理前后表达量出现了较大的变化。迄今为止，有关低温胁迫处理对矮牵牛生理代谢的影响鲜有报道。为此，试验对低温胁迫下矮牵牛H株系中的花青素以及渗透调节物质游离脯氨酸和可溶性糖的含量进行了测定，旨在探讨矮牵牛抗寒机制的发生过程，从而为矮牵牛抗寒机理研究提供参考。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对矮牵牛H株系花青素相对含量的影响

低温胁迫对矮牵牛H株系花青素相对含量的影响情况见表1。从表1可见，低温胁迫处理2 h和24 h后，矮牵牛H株系花青素的相对含量与对照相比均没有显著差异（P>0.05），当胁迫时间增至120 h后，矮牵牛H株系叶片中的花青素相对含量明显上升，与对照有显著差异（P<0.05），表明矮牵牛的花青素相对含量在胁迫处理后期受到了低温胁迫的影响。

2.2 低温胁迫对矮牵牛H株系游离脯氨酸含量的影响

低温胁迫对矮牵牛H株系游离脯氨酸含量的影响情况见表1。从表1可见，经低温胁迫处理2 h后，矮牵牛H株系的游离脯氨酸含量较对照有轻微的上升，但与对照的差异不显著（P>0.05）；在低温胁迫处理24 h后游离脯氨酸含量达到峰值，与对照差异显著（P<0.05）；当胁迫时间增至120 h，游离脯氨酸含量有所下降，但仍显著高于对照含量水平（P<0.05），表明矮牵牛的游离脯氨酸含量对低温胁迫的响应比较敏感，是紧密相联系的2个因素。

2.3 低温胁迫对矮牵牛H株系可溶性糖含量的影响

低温胁迫对矮牵牛H株系可溶性糖含量的影响情况见表1。从表1可见，在低温胁迫处理2 h后，矮牵牛H株系的可溶性糖含量即出现大幅上升，直到24 h仍保持较高的含量，当胁迫增至120 h，可溶性糖含量达到峰值。3个处理与对照都差异显著（P<0.05），表明矮牵牛的可溶性糖含量在胁迫处理早期即受到了低温的影响，反映出矮牵牛的可溶性糖含量对低温胁迫的响应非常敏感。

3 讨论

花青素是植物次生代谢产物，是类黄酮色素中最重要的一种水溶性化合物。花青素是构成花朵和果实色彩的主要色素之一，而且它的合成與积累也是植物抗逆机制之一[2]，可以清除自由基对植物组织的毒害，具有很强的保护作用[3]。Tholakalabavi等[4]研究发现，在对杨树愈伤悬浮细胞系进行渗透胁迫处理后，细胞中花青素的含量明显增加，并且由葡萄糖诱导的渗透胁迫产生的花青素含量比甘露醇诱导的渗透胁迫产生的花青素含量要高。张开明[5]在对四季秋海棠的研究中发现，低温处理后茎部和叶片可富集大量碳水化合物，且花色素合成的相关酶CHI、PAL、UFGT、DFR活性明显增强，尤其是秋季低温能诱导四季秋海棠花色素的合成，这其中碳水化合物的积累是其直接原因。陈静等[6]研究表明，花青素对低温弱光逆境处理的番茄叶片光合机制具有保护作用，并且推断这种保护作用与花青素对可见光与紫外光的吸收、屏蔽作用有关。许志茹等[7]对芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析中发现，BrDFR1P和BrDFR2P 序列中存在茉莉酸甲酯、脱落酸、低温应答等一些与抗逆性密切相关的顺式作用元件。Shvarts等[8]对矮牵牛进行中度低温（17～12 ℃）处理后，发现花冠中的花青素含量增加，并且查尔酮合成酶基因的表达增强。他们认为中度低温不仅可以增强合成花青素相关基因的表达，还能作为一种具体且独特的信号因子。本试验对矮牵牛进行低温胁迫处理后发现，叶片中花青素的相对含量在低温胁迫2 h和24 h后，与没有进行低温胁迫处理的对照相比并无明显变化，但在胁迫处理120 h后显著上升，可以初步推测花青素在低温胁迫的后期参与了应答响应，并发挥了其保护作用；且课题组前期的H株系表达谱芯片数据显示，一些和花青素代谢相关基因的表达在低温处理前后有明显差异，本次试验中关于花青素相对含量的测定进一步验证了芯片结果，而花青素参与到低温应答的分子机理有待于后续进一步的研究。

在植物细胞内，游离脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，它通过增加胞内溶质量，从而降低细胞冰点，防止植物细胞过度脱水，以削弱低温对细胞的损害[9]。以往学者在植物组织、器官和全株试验中的结果表明，脯氨酸的积累与抗渗胁迫之间呈现显著的正相关关系[10]，脯氨酸含量积累的多少可以作为植物抗逆性筛选中的指标之一[11]，且在不同逆境胁迫处理中都有广泛的应用[12-14]。冯昌军等[15]研究发现，苜蓿通过提高脯氨酸绝对含量等保护机制来适应低温胁迫，以减轻低温伤害。Gilmour等[16]报道，超量表达抗寒相关转录因子—CBF3的拟南芥植株中脯氨酸合成的关键酶，即P5CS的活性较野生型植株提高了4倍，其脯氨酸含量增加，可明显提高植株的抗寒能力。本试验发现，低温胁迫下矮牵牛叶片中游离脯氨酸的含量较对照均有所增加，且在处理24 h后达到峰值，说明低温胁迫下矮牵牛抗寒性的获得与游离脯氨酸含量的增加有一定的相关性。

目前普遍认为可溶性糖类的含量与植物抗寒性之间呈正相关关系[17]。在植物抗寒生理中，糖可以增加细胞的渗透浓度，降低水势，提高保水能力，从而使冰点下降[18]。早在1907年，瑞典科学家Lidforss就提出，碳水化合物在寒冷环境下对小麦有保护作用，后来被多位研究者证实[19]。本试验中，在对矮牵牛进行低温胁迫处理后，结果在处理前期2 h可溶性糖含量即出现较高程度的提升，并在此后的胁迫过程中保持着较高含量，推测可溶性糖含量的增加在低温胁迫过程中与提高植株抗寒性紧密相关。

参考文献：

[1] LI B， NING L Y， ZHANG J W， et al. Transcriptional profiling of Petunia seedlings reveals candidate regulators of the cold stress response[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6：118. doi： 10.3389/fpls.2015.00118.

[2] LEYVA A，JARILLO J A，SALINAS J，et al. Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase mRNAs of Arabidopsis thaliana in a light-dependent manner[J].Plant Physiology，1995，108（1）：39-46.

[3] TSUDA T， SHIGA K， OHSHIMA K， et al. Inhibition of lipid peroxidation and the active oxygen radical scavenging effect of anthocyanin pigments isolated from Phaseolus vulgaris L[J]. Biochemical Pharmacology，1996，52（7）：1033-1039.

[4] THOLAKALABAVI A，ZWIAZEK J J，THORPE T A. Effect of mannitol and glucose induced osmotic stress on growth，water relations，and solute composition of cell suspension cultures of poplar （Populus deltoides var. occidentalis） in relation to anthocyanin accumulation[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，1994，30（3）：164-170.

[5] 張开明.四季秋海棠（Begonia semperflorens）叶片中花色素苷的光保护作用和低温诱导机理[D].杭州：浙江大学，2010.

[6] 陈 静，陈启林，程智慧，等.花青苷对低温弱光处理的番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）幼苗光合机制的保护作用[J].中国农业科学，2007，40（4）：788-793.

[7] 许志茹，马 静，崔国新，等.芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析[J].园艺学报，2014，41（8）：1631-1641.

[8] SHVARTS M，BOROCHOV A，WEISS D. Low temperature enhances petunia flower pigmentation and induces chalcone synthase gene expression[J]. Physiologia Plantarum，1997，99（1）： 67-72.

[9] 王小华，庄南生.脯氨酸与植物抗寒性的研究进展[J].中国农学通报，2008，24（11）：398-402.

[10] 孙 功，沈向群，杨宜忱，等.矮牵牛长柱头性状遗传分析[J].种子，2011，30（2）：30-32.

[11] 汤章城.逆境条件下植物脯氨酸的累积及其可能的意义[J].植物生理学通讯，1984（1）：15-21.

[12] 刘娥娥，宗 会，郭振飞，等.干旱，盐和低温胁迫对水稻幼苗脯氨酸含量的影响[J].热带亚热带植物学报，2000，8（3）：235-238.

[13] 卢少云， 陈斯平，陈斯曼，等.三种暖季型草坪草在干旱条件下脯氨酸含量和抗氧化酶活性的变化[J].园艺学报，2003，30（3）：303-306.

[14] 王若梦，董宽虎，李钰莹，等.外源植物激素对NaCl胁迫下苦马豆苗期脯氨酸代谢的影响[J].草业学报，2014，23（2）：189-195.

[15] 冯昌军，罗新义，沙 伟，等.低温胁迫对苜蓿品种幼苗SOD、POD活性和脯氨酸含量的影响[J].草业科学，2005，22（6）：29-32.

[16] GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，et al. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J]. The Plant Journal，1998，16（4）： 433-442.

[17] 王荣富.植物抗寒指标的种类及其应用[J].植物生理学通讯，1987（3）：49-55.

[18] 王淑杰，王家民，李亚东，等.可溶性全蛋白、可溶性糖含量与葡萄抗寒性关系的研究[J].北方园艺，1996（2）：13-14.

[19] 张爱民，孙其信.有关小麦抗寒生理的研究概况[J].国外农学——麦类作物，1985（6）：32-35.