枯草芽孢杆菌21对玉米幼苗抗逆生理的影响

肖亚静　于春生　张新　张雨竹　孙冬梅

摘要：探究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对土传病原菌胁迫下玉米抗逆生理的影响。采用土壤盆栽试验，将禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和立枯丝核菌（Rhoctonia solani）接种到土壤中，用枯草芽孢杆菌21菌悬液处理，以多菌灵为对照。在玉米苗三叶一心期时，分别测定地上组织和地下组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量。枯草芽孢杆菌21处理与多菌灵处理相比，玉米地上组织SOD和CAT酶活性差异不显著，而POD酶活性提高了6.52%，地下组织抗逆酶活性显著提高，其中SOD酶活性提高了99.70%，CAT酶活性提高了27.43%，POD酶活性提高了13.24%；玉米地下部分MDA含量無显著差异，而地上部分MDA含量降低了7.91%。与多菌灵相比，枯草芽孢杆菌21主要通过提高玉米各组织中POD酶活性及地下组织中CAT酶活性，同时降低MDA含量，以提高其对土传病原菌的抗性，从而对玉米幼苗起到保护作用，使其免受土传病原菌的侵害。

关键词：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）； 土传病原菌； 抗氧化酶； 丙二醛； 多菌灵

中图分类号：S482.2+92；Q939.92 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-1998-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.021

Abstract： The effect of Bacillus subtilis strain 21 on maize resistance physiology under the stress of soil borne pathogens was studied. Using soil pot experiments， taking carbendazim as the control， bacterial liquid of B. subtilis strain 21 was inoculated into the soil， which had been inoculated with the two different pathogens， Fusarium graminearum and Rhoctonia solani. Three antioxidative enzymes and malonaldehyde contents in the aboveground and the underground organism of the maize at 3 leaf stage were determined. The results showed that the peroxidase activity was increased by 6.52% significantly in the aboveground organism in the soil treatment of B. subtilis strain 21， comparing with the treatment of carbendazim， and there was no significant change in the catalase activity and superoxide dismutase activity. The catalase activity， superoxide dismutase activity and peroxidase activity were significantly increased by 99.70%， 27.43%， 13.24%（P<0.05）， respectively， in the underground organism， comparing with the treatment of carbendazim. The malonaldehyde contents of the maize treated with B. subtilis strain 21 was reduced by 7.91% in aboveground organism comparing with the treatment of carbendazim， but there was no significant change in the malonaldehyde contents of the aboveground organism of the maize treated with. B.subtilis strain 21 has the ability of increasing peroxidase activity in all organisms of maize， catalase activity in underground organism of maize and decreasing MDA contents to protect the maize seedling from the injure of soil born pathogens， comparing with carbendazim.

Key words： Bacillus subtilis； soil borne pathogens； antioxidative enzyme； malonalde hyde； carbendazim

玉米茎腐病、纹枯病在中国各地均有发生，是一类具有毁灭性的土传真菌病害。一般应用化学农药对其进行防治，但化学农药具有残留期长，影响生态环境，易导致病原菌产生抗性等问题。目前利用生防菌剂控制玉米此类土传病害的生物防治已成为研究热点。现已发现多种微生物对玉米茎腐病、纹枯病土传病菌具有拮抗作用，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有营养需求简单、生长繁殖快、定殖能力强、易存活、抗逆性强、且具有促进植物生长及诱导植物抗性产生等特点[1，2]，因而被广泛研究。玉米茎腐病主要由镰刀属（Fusarium）和腐霉属（Pythium）引起，而中国东北三省则由多种镰刀菌引起，以禾谷镰刀菌（F. graminearum）、串珠镰刀菌（F. moniliforme）和茄镰刀菌（F. solani）出现频率最高，一般年份发病率为10%～25%，严重年份可达50%[3]。玉米纹枯病主要由立枯丝核菌（Rhoctonia solani）引起，一般年份发病率为40%，严重时发病率达70%[4，5]。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）是植物体内主要的ROS酶清除系统，植物受到病原菌侵害时，这些ROS酶清除系统作为信号分子介导植物对外界刺激产生相应的生理生化反应，使植物免受氧化损伤[6]。Ju等[7]从苹果中分离的一株枯草芽孢杆菌Y-1对镰刀菌和立枯丝核菌的菌丝生长具有显著的抑制作用，体内试验防治效果达92.26%，使苹果体内超氧化物歧化酶和过氧化物酶酶活性增强，产生诱导抗性。李德全等[8]研究发现枯草芽孢杆菌Bs-916及其突变菌株对水稻具有诱导抗性，使水稻体内多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶和过氧化物酶3种酶的酶活性提高。有关生防菌对土传病原菌胁迫下玉米体内抗逆生理特性的研究相对较少，本课题组前期从土壤中分离并鉴定出一株枯草芽孢杆菌21，通过平板对峙试验发现其能显著地抑制禾谷镰刀菌和立枯丝核菌菌丝的生长。为了研究枯草芽孢杆菌21对土传病原菌胁迫下玉米的生防机制，采用盆栽试验，测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶3种抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量变化。以玉米为研究对象，在玉米三叶一心期，比较枯草芽孢杆菌21和多菌灵对土传病原菌胁迫下玉米幼苗地上组织和地下组织中3种抗氧化酶活性和丙二醛含量变化，为深入研究枯草芽孢杆菌生防机制和研发生防菌剂奠定基础，同时对阐明玉米抗病性、拮抗菌生防机制及其生产应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

生防菌为黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院实验室筛选的枯草芽孢杆菌21菌株，该菌株发酵用牛肉膏蛋白胨液体培养基[9]。病原菌为禾谷镰刀菌和立枯丝核菌，均由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院实验室保存，立枯丝核菌用PDA液体培养基[9]培养，禾谷镰刀菌用PDA固体培养基[9]培养。

供试玉米为4单19。供试土壤为大庆市种植作物土壤。

1.2 方法

1.2.1 生防菌發酵 将保存于-20 ℃的枯草芽孢杆菌菌株21转接到斜面试管活化，然后利用平板划线法纯化该菌株，单菌落扩增后接种到液体培养基中，35 ℃、180 r/min培养24 h作为种子液，以8%的接种量接入到牛肉膏液体培养基中，相同条件下振荡培养24 h，发酵液活菌数达到8.56×107 cfu/mL，备用。

1.2.2 病原菌准备 将保存于-20 ℃的禾谷镰刀菌和立枯丝核菌利用PDA斜面试管活化，并制备镰刀菌孢子悬液，使孢悬液浓度达到7.19×106 个/mL；活化好的立枯丝核菌28 ℃、120 r/min培养6 d，得到菌丝球，将菌丝球经三层纱布过滤并用无菌水冲洗3次，榨汁机打碎，制备好的两种病原菌等体积混合备用。

1.2.3 玉米种子处理 取健康、饱满的供试玉米种子，用50～60 ℃无菌水处理10 min，冲洗3次，无菌水浸泡至其露白。

1.2.4 试验设计 盆栽试验设有3个处理：①病原菌；②病原菌+10 mL生防菌剂；③病原菌+25%多菌灵（0.094 g/盆）。每处理病原菌用量为30 mL/盆，每处理与风干土混匀后装入塑料盆（直径15 cm，高14.6 cm）中。每处理重复3次，每重复1盆，每盆播种15粒处于萌动状态的玉米种子，留取大小一致的玉米苗，2片叶，每盆5棵。试验期间，不同处理盆栽管理一致。播种后每隔2 d浇水1次，每盆每次浇水量相同。

1.2.5 枯草芽孢杆菌菌株21对土传病原菌胁迫下玉米抗逆生理的影响 试验于2014年4～7月在黑龙江八一农垦大学土壤微生物资源利用实验室进行。试验采用盆栽法，取三叶一心期玉米苗，冲洗根部泥土，粗滤纸吸干表面水分，分离地上部分和地下部分，分别称重，液氮速冻后放入-80 ℃保存。取1.0 g玉米组织置于预冷研钵中，加入10 mL 0.05 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆液4 ℃、4 000 r/min离心20 min，上清液即为酶粗提液，采用四氮唑蓝光化还原法[10]测定超氧化物歧化酶活性，100 μL粗酶液和3 mL反应液在4 000 LX光照条件下反应30 min，黑暗终止反应，560 nm下测定OD值，以抑制NBT光化反应50%为一个酶活单位计算酶活性。采用愈创木酚法[11]测定POD酶活性，紫外吸收法[2]测定CAT酶活性，硫代巴比妥酸法[12]测定丙二醛含量。

1.3 数据处理

采用SPSS13.0软件Duncan氏新复极差检测法进行差异显著性分析；Excel2007软件作图。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌菌株21对土传病原菌胁迫下玉米幼苗抗逆生理的影响

2.1.1 对超氧化物歧化酶的影响 超氧化物歧化酶是植物体内重要抗逆酶之一，可由多种生物因子和非生物因子诱导产生，能够清除体内超氧阴离子，保护植物免受病原菌侵害或逆境条件下产生的氧化损伤，是植物抵抗病原菌侵染的主要防卫反应之一[13]。由表1可知，不同处理对玉米幼苗地上组织中SOD酶活性的影响在数值上有一定的变化，但差异不显著。不同处理对玉米幼苗地下组织SOD酶活性影响不同（表2），与病原菌处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理SOD酶活性无显著差异，病原菌+25%多菌灵处理SOD酶活性降低了52.20%，差异显著。由此可知，枯草芽孢杆菌21菌株主要通过改变玉米幼苗地下部分SOD酶活性来提高其对土传病原菌抗性，这可能与玉米幼苗根部与土传病原菌及枯草芽孢杆菌21互作有关。与多菌灵相比，枯草芽孢杆菌21菌株发酵液降低了土传病原菌胁迫下玉米幼苗地下组织中SOD酶活性，从而更好地保护玉米幼苗免受土传病原菌的侵害。

2.1.2 对过氧化氢酶的影响 过氧化氢酶是植物体内清除H2O2的主要抗逆酶之一，可以彻底清除O2-对植物的氧化损伤，保护植物免受病原菌的侵害[14]。从表1和表2可以看出，不同处理对玉米幼苗地上组织和地下组织CAT酶活性产生不同程度的影响。就玉米幼苗地上组织而言，与病原菌处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理CAT酶活性降低但差异不显著，病原菌+25%多菌灵处理CAT酶活性降低了28.49%，且差异显著，而病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理与病原菌+25%多菌灵处理间无显著差异。玉米幼苗地下组织中，与病原菌处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理CAT酶活性显著提高了31.17%，而病原菌+25%多菌灵处理无显著差异；与病原菌+25%多菌灵处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理CAT酶活性显著提高了27.43%。说明枯草芽孢杆菌21菌株发酵液主要通过调控玉米幼苗地下组织CAT酶活性，来降低土传病原菌对其侵害程度，且枯草芽孢杆菌21菌株发酵液可以显著提高土传病原菌胁迫下玉米幼苗地下组织CAT酶活性，从而保护玉米幼苗免受土传病原菌的侵害，且效果优于多菌灵。

2.1.3 对过氧化物酶的影响 过氧化物酶是植物体内抗逆酶之一，催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机物和无机物的氧化作用[15]。由表1可知，不同处理间玉米幼苗地上组织POD酶活性差异显著。与病原菌处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理POD酶活性提高了9.90%，病原菌+25%多菌灵处理提高了3.17%，与病原菌+25%多菌灵处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理POD酶活性提高了6.52%，且差异显著。

不同处理对玉米幼苗地下组织POD酶活性影响不同（表2）。与病原菌处理组相比，病原菌+25%多菌灵处理无显著差异，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理显著提高了8.15%。说明枯草芽孢杆菌21菌株使土传病原菌胁迫下玉米幼苗地上组织和地下组织POD酶活性同时提高，且与多菌灵相比，枯草芽孢杆菌21能显著提高土传病原菌胁迫下玉米幼苗POD酶活性，从而保护玉米幼苗免受土传病原菌的侵害。

2.1.4 对丙二醛的影响 丙二醛（MDA）是植物組织器官在衰老或逆境条件下，脂质过氧化最终分解产物，反映了细胞膜受活性氧和自由基损害程度的大小[16]。不同处理对土传病原菌胁迫下玉米幼苗地上部分MDA含量的影响不同（图1A）。与病原菌处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理和病原菌+25%多菌灵处理MDA含量分别降低了26.32%和19.99%，与病原菌+25%多菌灵处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理MDA含量显著降低了7.91%。

由图1B可知，与病原菌处理相比，病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理和病原菌+25%多菌灵处理的玉米幼苗地下组织MDA含量分别降低了32.47%和32.78%，且差异显著，而病原菌+10 mL枯草芽孢杆菌21处理和病原菌+25%多菌灵处理无显著差异。说明枯草芽孢杆菌21可以降低土传根腐病原菌胁迫下玉米幼苗膜脂过氧化程度，降低MDA含量，从而对玉米幼苗的生长起到保护作用。地上组织的研究结果表明，枯草芽孢杆菌21效果优于多菌灵。地下组织的研究结果表明，枯草芽孢杆菌21和多菌灵的效果相当，因此，该生防菌有较高的利用价值。

3 小结与讨论

植物抗逆酶的诱导产生与植物抗性机制密切相关[17]。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶是植物体内抗氧化酶促防御系统中3个主要酶类，当植物受病原菌胁迫时，体内自由基大量增生，使酶活性发生改变，3种酶协同作用可以降低植物体内活性氧水平，减轻自由基对植物体造成的伤害，提高植物机体抗逆能力[18]。

3.1 土传病原菌胁迫下玉米幼苗抗氧化酶活性

韦巧婕等[19]研究表明，黄瓜枯萎病拮抗菌芽孢杆菌属菌株B能显著提高黄瓜体内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性，提高黄瓜抗病能力。本研究表明，施用枯草芽孢杆菌21并未提高土传病原菌胁迫下的玉米幼苗地上组织中SOD和CAT酶活性，而使POD酶活性提高，枯草芽孢杆菌21对土传病原菌胁迫下玉米幼苗地下组织SOD酶活性无显著影响，但可以诱导其产生POD和CAT，由此可知枯草芽孢杆菌21主要通过提高玉米各组织中POD酶活性及地下组织中CAT酶活性，以提高其对土传病原菌的抗性，从而对玉米幼苗起到保护作用。

3.2 土传病原菌胁迫下玉米幼苗丙二醛含量变化

曾嵘等[20]研究发现黑胫病生防菌能显著提高不同抗性烟草品种叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶酶活性，并显著降低MDA含量的增长速度。本研究表明枯草芽孢杆菌21可以降低土传根腐病原菌胁迫下玉米幼苗膜脂过氧化程度，降低MDA含量，从而对玉米幼苗的生长起到保护作用，且效果优于多菌灵。

通过盆栽试验可知，与多菌灵相比，枯草芽孢杆菌21可以诱导土传病原菌胁迫下玉米幼苗产生抗氧化酶，从而对其产生保护性。与多菌灵相比，施用生防菌枯草芽孢杆菌21菌株，能更有效地降低土传病原菌对玉米组织的损伤程度，其作用机制可能是通过提高玉米地下组织抗逆酶活性，进而提高玉米的防病能力，因而该菌株具有进一步研究和应用的价值，但其对土传病原菌的田间防治效果如何还有待于进一步研究。

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