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脑死亡状态猪血清炎性介质水平与肝脏早期损伤的关系

2016-10-19赵静雯唐缨牛宁宁于慧敏刘洋

山东医药 2016年34期
关键词:脑死亡超微结构电镜

赵静雯,唐缨,牛宁宁,于慧敏,刘洋

(天津市第一中心医院,天津300192)



·基础研究·

脑死亡状态猪血清炎性介质水平与肝脏早期损伤的关系

赵静雯,唐缨,牛宁宁,于慧敏,刘洋

(天津市第一中心医院,天津300192)

目的探讨巴马小型猪在脑死亡状态下血清炎性介质水平与肝脏早期损伤的关系。方法 采用颅内渐进加压法建立猪脑死亡模型6只,分别于脑死亡前及脑死亡后0、3、6、9 h取血,ELISA法检测血清炎性介质IL-1β、IL-6、TNF-α;同时穿刺取肝组织,电镜下行肝组织损伤评分。结果猪血清IL-6水平自脑死亡0 h开始升高,9 h与脑死亡前比较差异显著(P<0.01);而血清IL-1β和TNF-α水平在脑死亡前后及脑死亡后各时点均无统计学差异(P均>0.05)。随脑死亡时间延长,电镜下猪肝组织逐渐出现不可逆性损伤,脑死亡后9 h较脑死亡前及脑死亡后0 h肝组织损伤评分升高(P=0.007、0.035)。脑死亡猪血清IL-6水平与电镜肝组织损伤评分呈正相关(r=0.702,P=0.000)。结论猪血清炎性介质IL-6水平随着脑死亡时间延长逐渐升高,与脑死亡状态下肝脏的早期损伤可能有关。

肝脏移植;脑死亡;供体;炎性介质;肝脏损伤;动物实验

脑死亡供体已成为肝脏移植的主要供体来源[1],但由于脑死亡状态复杂的血流动力学改变、内分泌系统紊乱和代谢功能障碍等因素,严重影响供体肝脏的质量[2]。有研究表明,脑死亡缺血缺氧状态可导致剧烈的氧化应激反应。活化后的细胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α等多种炎性介质,参与机体的免疫应答[3]。2015年9月~2016年3月,我们检测了猪脑死亡不同时点的血清IL-1β、Il-6及TNF-α,探讨脑死亡过程中炎性介质变化与肝组织超微结构改变的关系。

1 材料与方法

1.1脑死亡模型的建立取巴马小型猪6只,雌雄不限,8~12月龄,体质量(32±0.5)kg,由天津蓟县实验动物基地提供。术前禁食24 h、禁水12 h,肌内注射氯胺酮10 mg/kg、安定0.4 mg/kg、阿托品0.03 mg/kg行基础麻醉,取仰卧位固定。静脉注射氯胺酮1 mg/kg、氯化琥珀胆碱注射液1 mg/kg,吸入2.5%~3.0%七氟烷维持全身麻醉;气管内插管维持呼吸,颈总动、静脉插管记录动脉血压、心率和中心静脉压,置入气囊导尿管。参照Pratschke等[4]和Alonso等[5]的颅内渐进加压方法并改进,建立脑死亡模型。脑死亡判定参照相关标准[6,7],首次判定全部符合,观察12 h无变化,方可判定为脑死亡,确认脑死亡后维持24 h。

1.2血清IL-1β、IL-6、TNF-α检测分别于脑死亡前及脑死亡0、3、6、9 h取上腔静脉血5 mL,静置30 min后3 000 r/min离心10 min,取上清-80 ℃保存。ELISA法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α,试剂盒购自美国USCN公司,按说明书操作。

1.3肝组织超微结构观察取血同时进行肝脏穿刺,获得组织大小≥0.5 mm3,固定于2.5%戊二醛溶液,电镜下行肝损伤评分。根据线粒体肿胀轻重分别计0、1分,外膜破裂轻重分别计1、2分;内质网扩张轻重分别计0、1分;纤维化轻、中、重分别计0、1、2分。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料比较,采用单因素方差分析及LSD检验;计数资料比较采用秩和检验;相关关系采用Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1脑死亡前后猪血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化见表1。

2.2脑死亡前后电镜下猪肝组织损伤评分比较脑死亡后9 h与脑死亡前及脑死亡后0 h肝组

表1    脑死亡前后不同时点猪血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

注:与脑死亡前比较,*P<0.05。

织损伤评分有统计学差异(P=0.007、0.035)。见表2。

表2    脑死亡前后不同时点电镜下猪肝组织损伤评分结果(只)

2.3脑死亡猪血清IL-6水平与电镜下肝组织损伤评分的关系Spearman相关分析显示,脑死亡猪血清IL-6水平与电镜下肝组织损伤评分呈正相关(r=0.702,P=0.000)。

3 讨论

IL-1β主要由活化的单核巨噬细胞产生,在发热、免疫应答、炎症反应、伤口愈合以及刺激造血中起重要作用[8]。IL-6可由单核巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞及T细胞产生,是机体免疫-神经-内分泌网络调节的主要分子,在免疫及炎症损伤中起重要作用。TNF-α可由多种细胞分泌,肝脏中的Kuppfer细胞是其主要来源,可通过诱导氧自由基产生及活化中性粒细胞、单核巨噬细胞等介导炎症损伤[9]。本研究结果显示,猪血清IL-6水平逐渐升高,到脑死亡后9 h与脑死亡前有显著性差异;血清IL-1β和TNF-α水平在脑死亡前后稍有波动,但无显著性差异。研究显示[10,11],在脑死亡状态下机体血液循环中IL-6水平显著升高。其原因可能是IL-6对于脑死亡状态下的交感神经异常及缺血缺氧应激反应较IL-1β和TNF-α更敏感,有待进一步验证。

电镜下观察脑死亡猪肝组织超微结构改变包括线粒体肿胀、外膜破裂,内质网扩张,细胞外基质胶原蛋白增多[12]。其中,线粒体肿胀是可以恢复的,但是,如果线粒体肿胀到一定程度导致外膜破裂,为不可逆改变;在脑死亡状态时肝脏细胞间基质胶原蛋白可增加数倍,导致肝纤维化,该过程也为不可逆改变[13]。在本研究中,随着脑死亡时间延长,实验动物肝脏超微结构出现以上变化,在脑死亡后9 h最明显。因此,我们初步认定在脑死亡后9 h猪肝脏细胞出现了不可逆的损伤。

综上所述,在脑死亡早期过程中,猪血清IL-6水平随时间延长不断升高,并与肝组织超微结构改变具有良好的相关性,提示对脑死亡早期的肝脏炎症损伤可能存在一定促进作用,但其机制有待进一步研究。

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天津市卫生行业重点攻关项目(13KG102);天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCYBJC27000)。

唐缨(E-mail: doctortang2010@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.008

R446.11

A

1002-266X(2016)34-0023-02

2016-05-13)

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