动物气溶胶吸入暴露装置的研制*

李劲松　杨文慧　何春雷　李　娜　王　洁　胡凌飞　李金忠　张　珂

动物气溶胶吸入暴露装置的研制*

李劲松①*杨文慧①△何春雷②李娜①王洁①胡凌飞①李金忠②张珂①

目的：根据吸入药物治疗、疫苗气溶胶免疫和吸入毒理等研究及评价的需要，研制一种可进行包括药物、疫苗、微生物气溶胶、PM2.5粒子及纳米粒子等气溶胶动物吸入暴露的新装置。方法：根据小鼠、大鼠和豚鼠等实验动物的大小、呼吸量、一次实验的动物数量以及气溶胶均匀性要求，设计动物气溶胶吸入暴露系统；依据实验室生物安全和防护的要求，设计暴露装置的负压隔离防护系统；并对该装置进行性能测试验证。结果：经实验测试，该装置具有动物吸入暴露、防护功能，其性能达到了相关标准的要求。结论：动物气溶胶吸入暴露装置可进行动物气溶胶吸入暴露实验，具有对实验环境和人员的防护功能，以及对实验过程的压力、温湿度和含氧量实时监测的功能，适用于毒理、病原微生物和疫苗等气溶胶暴露研究的实验室。

气溶胶；实验动物；吸入暴露设备；设计原理

［First-author’s address］ Key Laboratory of Biological Safety of Pathogenic Microorganisms， Institute of Microbiology Epidemiology， Academy Military Medical Sciences， Beijing 100071， China.

药物气溶胶吸入治疗、疫苗吸入免疫及各种吸入毒理学研究均需要有能够进行定量和定性研究的动物气溶胶吸入暴露技术平台，而实验动物气溶胶吸入暴露设备则是该平台的核心技术和设备［1-7］。目前，多数实验室的气溶胶吸入暴露均采用实验动物全身气溶胶暴露技术和设备，由于全身暴露存在消化道、破损皮肤暴露等多途径暴露的缺陷，研究人员越来越希望使用动物呼吸道吸入暴露系统。动物气溶胶吸入暴露装置的技术复杂，难以统一技术标准，国外高级研究机构均自行设计试制动物气溶胶吸入暴露系统［8-14］。本研究项目建立了动物气溶胶吸入暴露技术，研制出气溶胶暴露设备，以满足动物气溶胶吸入暴露研究的需要。

1　动物气溶胶吸入暴露装置的整体设计

动物气溶胶吸入暴露装置由气溶胶动物吸入暴露系统和负压隔离防护系统两部分构成。

1.1设计原理

实验动物气溶胶吸入暴露是将动物的口鼻暴露在特定粒径范围内气溶胶环境下，通过动物自主呼吸吸入气溶胶完成吸入途径暴露的实验过程。气溶胶吸入暴露系统根据功能划分为5个子系统设计：即动物暴露腔、气溶胶发生与传输、暴露腔环境参数监控、空气净化系统和系统控制系统。气溶胶吸入暴露系统整体结构设计如图1所示。

1.1.1子系统设计

该子系统是气溶胶动物吸入暴露系统的核心，由实验动物固定舱、气溶胶管道及气溶胶室3部分构成。动物在吸入暴露时被固定于该系统中，经口鼻主动吸入气溶胶。动物暴露腔可以容纳18～30个动物同时吸入暴露，分为上、中、下3层。每层及整个暴露腔均可旋转，以便于操作（如图2所示）。

图1　动物暴露系统结构设计图

图2　气溶胶动物暴露腔原理样机的设计方案图

动物固定舱采用透明医用钢化玻璃材质，方便观察，可高压灭菌。设计橡胶塞密封结构，将固定舱插入暴露装置前，固定舱与暴露装置需同时打开橡胶塞，然后插入鼠仓，实现固定舱与暴露装置间的气体交换。暴露实验完成后，将固定舱拔出，固定舱接口与暴露装置接口同时用硅橡胶密封盖密封。固定舱后部设计有用来交换空气的高效过滤器装置，可保证固定舱在接口用硅橡胶密封盖密封后的内外空气交换（如图3所示）。

图3　旋转气溶胶吸入暴露腔实物图

1.1.2气溶胶发生与传输子系统设计

设计新型气溶胶发生器。在喷气口高速气流的作用下，菌液喷出口形成负压，将发生器里的菌液吸至喷嘴处后被喷气口高速气流碎裂或分散成无数的气溶胶粒子，经喷雾口喷出。新型气溶胶发生器有2个外接口，一个为连接气源的供气接口；另一个为注液和喷雾两用接口，新型气溶胶发生器所需达到的技术指标见表1。

表1　气溶胶发生器技术指标

1.1.3暴露腔环境参数监控

暴露腔中的温度、湿度、压力、氧气及二氧化碳的稳定和变化可直接影响受试动物的生理状态，进而影响实验结果。为了保障动物实验过程中温度、湿度、压力、氧气及二氧化碳的稳定，本研究引入各种因素监测传感器，传感器的设计和规格均适用于动物暴露系统，通过自动传输和储存测量值的专用接口进行电子数据的采集。各种监测传感器的功能为：①温度湿度组合传感器用于监测实验环境；②氧气和二氧化碳传感器用于测试暴露腔内的浓度；③压力传感器适用于暴露单元和暴露腔内部压监测。同时，传感器的应用和设计增加了隔离密封舱内压力、暴露舱内压力、温度、湿度以及含氧量的实时测试功能，更加准确地监控试验受体的实验环境，保证实验动物环境的温度、湿度及含氧量符合试验要求。

1.1.4空气净化系统子系统

暴露腔中排出的空气含有高浓度的生物气溶胶、药物气溶胶及其他成分气溶胶等实验气溶胶，负压隔离防护舱排除的空气含有低浓度的实验气溶胶，其气溶胶对实验人员和实验室环境有害，必须要严格控制和进行无害化处置。因此，在2个空气排出口后部和排风风机前部设置一道高效粒子过滤器，必要时可设置两道高效粒子过滤器，使排除的空气得到净化处置，实现无害化。

1.1.5系统控制子系统

气溶胶动物吸入暴露系统由5个子系统构成，每个子系统之间的相互协调、平衡方能保障整个系统可靠运行，完成动物的吸入暴露实验。因此，系统控制子系统的设计充分兼顾下列因素：①动物暴露腔的温度、湿度、氧含量及压力等因素；②气溶胶发生与传输的喷雾流量、喷雾压力等因素；③空气净化系统启动时间、净化时间等因素。综合其各种影响因素分模块进行系统设计，按动态监测和实验程序进行系统集成（如图4所示）。

图4　电路控制设计图

1.2负压隔离防护系统的设计

（1）负压隔离防护系统是为了操作人员及其周围环境的安全，具有负压、气密隔离及空气自循环消毒净化的一种生物安全防护系统。为了使用者的操作便捷性和安全性，负压隔离防护系统主体样机的设计外壳采用双层结构，内胆为316不锈钢一体成型结构，全部采用优质不锈钢拉丝板材焊接完成，设计大直径折弯圆角，方便清洗和消毒，同时避免气流死角，保障负压隔离防护系统内部无菌环境，防止实验过程中交叉污染的可能。外部采用冷轧钢板喷塑。采用负压双层箱体保护结构，且整个回风通道相对于外界始终处于负压状态，能有效地将污染气溶胶密封在负压隔离防护系统内，使负压隔离防护系统进一步对操作人员和环境的保护构成了有效的安全保障系统。采用鸥翼式双开门设计，设计上开门结构、磁吸式密封胶条密封以及失压报警功能，保证密封安全，方便用户操作。

（2）负压隔离防护系统设计有高效过滤排风系统和光氢离子消毒系统。高效过滤排风系统可将操作区域内的污染空气经高效过滤器过滤净化达到无害处置后排放，并安装消音装置减小噪音，保护操作者的身体健康和环境均有良好效果。同时，在负压隔离舱内对称安装有2台光氢离子净化器，对负压隔离防护系统自动消毒，光氢离子净化器不仅能够分解有机物为二氧化碳与水，并具有较高的杀灭微生物功能。

2　动物气溶胶吸入暴露装置的试制与系统集成

2.1装置的试制

动物气溶胶吸入暴露装置是按照国际和国内权威机构标准设计生产，可完成啮齿实验动物的吸入暴露状态下的气溶胶吸入毒理实验，实验包括急性、亚急性、慢性及亚慢性。

有可调空气搅拌功能保证气溶胶分布均匀，气溶胶可充分混合输送给受染动物，气溶胶浓度的均匀定量和可靠运转，整个实验过程，暴露腔内的温度、湿度、压差和氧浓度全过程实时监控。上位机控制系统控制气溶胶动物吸入暴露实验，可随时观察并记录相关参数。动态显示其数值与实时曲线、实时报警与记录、历史数据、历史曲线自动保存记录以及历史报表查询，并可进行打印，且数据导出简便。

负压隔离防护系统内腔容积1 m3；316不锈钢内胆，且具有透明观察口，能现场观察动物的活动情况。负压隔离舱的压力为-5～-50 Pa，可防止气溶胶泄漏污染实验室环境。负压隔离防护系统内置光氢离子发生器，可设置消毒时间，消毒完成后自动关闭。

本研究研制的产品与国际同类产品相比，创新性地引入可传递式鼠舱、暴露装置主体旋转平台，并采用高性能的隔离密封系统，集成实施暴露舱压力、温度、湿度及含氧量的监测功能。动物气溶胶吸入暴露装置已由青岛众瑞智能仪器有限公司设计和生产，完成了产品技术标准制定和备案，并已应用于疫苗吸入评价和药物吸入评价实验中（如图5所示）。

图5　负压隔离防护系统成品图

该装置具有智能化操作的特点，可减少人工操作的环节，整个装置操作简单，操作界面简洁明了（如图6所示）。

图6　实验运行状态与结束状态显示屏界面图

2.2装置的技术特点

动物气溶胶吸入暴露装置的技术特点：①提供最多18只大鼠、小鼠或豚鼠的单一浓度吸入式暴露；

3　动物气溶胶吸入暴露装置的性能验证

3.1负压隔离防护系统气密性测试

实验前在隔离密封舱外使用Andersen 2级采样器对舱外进行本底采样，采样时间为5 min。启动密封舱后，在舱内发生气溶胶实验模式菌—粘质沙雷氏菌的气溶胶，浓度为106cfu/ml，喷雾10 min后，使用采样器在舱内及舱外出风口同时采样，重复实验3次。使用噬菌体phiX174作为模拟病毒气溶胶，依照上述操作重复实验3次。

发生106cfu/ml粘质沙雷氏菌发生液后，对隔离密封舱舱内和舱外的粘质沙雷氏菌气溶胶浓度进行检测，通过计算3次实验过滤效率依次为99.94%、99.98%及99.93%，平均过滤效率为（99.95±0.00）%（见表2）。

表2　粘质沙雷氏菌气溶胶气密性测试结果(cfu/m3)

发生106cfu/ml噬菌体phiX174发生液后，对隔离密封舱舱内和舱外的噬菌体phiX174气溶胶浓度进行检测，通过计算3次实验过滤效率均为100%，平均过滤效率为100%（见表3）。

表3　噬菌体phiX174气溶胶气密性测试结果(cfu/m3)

3.2气溶胶分布均匀性测试

对建立的动物气溶胶暴露系统，进行所有气溶胶粒子和生物气溶胶粒子分布是否均匀的评价。使用粘质沙雷氏菌8039作为指示微生物模拟细菌气溶胶，TSI3321气溶胶测试仪测试了所有粒子分布情况，Andersen 6级微生物采样器检测生物粒子气溶胶的分布情况。

发生粘质沙雷氏菌浓度为2×106cfu/ml，在喷雾16 min、32 min及59 min时对暴露装置上、中、下3层同时用Andersen6级采样30 s，在喷雾10 min、26 min及50 min时对上、中、下3层用TSI3321采样10 min。通过统计学分析，粘质沙雷氏菌气溶胶Anderen6级采样器对生物粒子的采样结果为上、中、下3层之间浓度无明显差异，TSI3321采样器对总粒子数的采样结果为上、中、下3层之间有轻微差异。重复采样3次的实验结果如图7所示。

图7　粘质沙雷氏菌气溶胶均匀度TSI3321测试结果柱状图

3.3实验系统消毒效果测试

启动密封舱后，在舱内发生气溶胶实验模式菌—粘质沙雷氏菌的气溶胶，浓度为106cfu/ml，喷雾10 min后，消毒前舱内气溶胶本底浓度为（58634±40632 cfu/m3，开启消毒设备，运行消毒功能30 min和60 min时对舱内进行采样，采样器为Anderen2级采样器，采样时间为5 min。消毒后30 min和60 min舱内气溶胶浓度检测结果均为0。由此可见舱内的粘质沙雷氏菌气溶胶在消毒功能运行30 min时便被彻底杀灭，本装置的光触媒消毒系统对模式细菌气溶胶的消毒效率达到100%，重复实验3次（见表4）。

表4　粘质沙雷氏菌气溶胶消毒效果测试平皿菌落数(cfu/min)结果

噬菌体phiX174气溶胶作为病毒气溶胶指示物测得的装置消毒效果显示，消毒前舱内气溶胶本底浓度为（2686±1679）cfu/m3，消毒后30 min和60 min舱内气溶胶浓度检测结果均为0。由此可见，舱内的噬菌体phiX174气溶胶在消毒功能运行30 min时便被彻底杀灭，本装置的光触媒消毒系统对模式病毒气溶胶的消毒效率同样达到100%（见表5）。

表5　噬菌体phiX174气溶胶消毒效果测试平皿菌落数结果(cfu/min)

4　结论

本研究研发出一款功能完善的动物气溶胶吸入暴露装置，该装置具有负压隔离防护系统，以及压力、温湿度及含氧量实时监测功能，创新性地引入了可传递式鼠仓和暴露装置主体旋转平台。动物气溶胶吸入暴露装置对微生物气溶胶的平均过滤效率≥99.99%，对模式微生物气溶胶的消毒效果均为100%，表明该装置对实验人员和实验室环境安全防护性能优越。该装置气溶胶分布均匀，粘质沙雷氏菌气溶胶浓度在上、中、下3层之间无明显差异，总粒子数的采样结果为3层之间有轻微差异，表明该装置气溶胶分布均匀，满足单一浓度的实验需要。

动物气溶胶吸入暴露装置可广泛应用于呼吸道传染病的吸入治疗、吸入免疫及气溶胶吸入毒理等领域的研究和实验评价。该装置已经申报一种动物气溶胶暴露实验系统、一种可精确控制感染量的动物气溶胶暴露实验系统和一种可快速自净的动物气溶胶暴露实验系统3项专利。

［1］Zhang L，Yu CP.Empirical equations for nasal deposition of inhaled particles in small laboratory animals and humans［J］.Aerosol Sci Tech，1993，19（1）：51-56.

［2］Reed DS，Martinez MJ.Respiratory immunity is an important component of protection elicited by subunit vaccination against pneumonic plague［J］.Vaccine，2006，24（13）：2283-2289.

［3］Morris SR.Development of a recombinant vaccine against aerosolized plague［J］.Vaccine， 2007，25（15）：3115-3117.

［4］Wimer-Mackin S，Hinchcliffe M，Petrie CR，et al. An intranasal vaccine targeting both the Bacillus anthracis toxin and bacterium provides protection against aerosol spore challenge in rabbits［J］.Vaccine，2006，24（18）：3953-3963.

［5］Vipond J，Simon OC，Hatch GJ，et al.Reformulation of selected DNA vaccine candidates and their evaluation as protein vaccines using a guinea pig aerosol infection model of tuberculosis［J］.Tuberculosis，2006，86（3-4）：218-224.

［6］Tigertt WD，Benenson AS，Gochenour WS.Airborne Q fever［J］.Bact rev，1961，25（9）：285-293.

［7］Yeh HC，Schum GM，Duggan MT.Anatomic models of the tracheobronchial and pulmonary regions of the rat［J］.Anat Rec，1979，195（3）：483-492.

［8］温占波，李娜，李劲松，等.动物口鼻动态气溶胶暴露系统的建立与效果评价［J］.解放军预防医学杂志，2012，30（6）：402-405.

［9］Ivins B，Fellows P，Pitt L，et al.Experimental anthrax vaccines：efficacy of adjuvants combined with protective antigen against an aerosol Bacillus anthracis spore challenge in guinea pigs［J］.Vaccine，1995，13（8）：1779-17134.

［10］Oldham MJ，Phalen RF，Thomas Budiman. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/C mice in a new Nose-Only exposure system［J］.Aerosol Sci Tech，2009，43（10）：970-977.

［11］Wong BA.Inhalation exposure systems：design，methods and operation［J］.Toxicol Pathol，2007，35（1）：3-14.

［12］Nadithe V，Rahamatalla M，Finlay WH，et al. Evaluation of Nose-Only aerosol inhalation chamber and comparison of experimental results with mathematical simulation of aerosol deposition in mouse lungs［J］.J Pharm Sci，2003，92（5）：1066-1076.

［13］Rabbe OG，Yeh HC，Schum GM，et al.Tracheobronchial geometry：human，dog，rat，ham ster，Lovelace Foundation Report LF-53［R］. Albuquerque，NM：Lovelace Foundation，1976.

［14］Raabe OG，Al-Bayati MA，Teague SV，et al. Regional deposition of inhaled monodisperse coarse and fine aerosol particles in small laboratory animals［J］.Ann Occup Hyg，1988，32（Suppl.1）：53-63.

Development of an animal exposure device to aerosol inhalation

LI Jin-song， YANG Wen-hui， HE Chun-lei， et al

China Medical Equipment，2016，13（9）:1-5.

Objective: To develop a new animal aerosol exposure device making inhalation toxicology investigation for drug aerosol， vaccine aerosol， microbiology aerosol， PM2.5 particles and nanoparticles according to the research and evaluation on the treatment of drug inhalation，vaccine aerosols and toxicology inhalation. Methods: According to the size， respiratory volume， quantity of the experiment animal （including mice， rats and guinea pigs etc） and aerosol homogeneity， the animal aerosol exposure system has been designed. According to the requirements of laboratory biosafety and protection， the negative pressure protection system has been designed. The performance of the device have been tested and validated. Results: The performance of the device is up to relative standards by comparing with the testing results. Conclusion: The device has been used for animal aerosol exposure experiment. The device protects experimental environment and operators from experimental aerosol， and can monitor the pressure， temperature， relative humidity，oxygen concentration of the exposure system in real time. It also can be suitable for all kinds of animal aerosol exposure in laboratory.

Aerosol； Experiment animal； Inhaled exposure apparatus； Design and principle

1672-8270（2016）09-0001-05

R-331

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.09.001

2016-06-19

△共同第一作者：杨文慧

国家科技重大专项（2012ZX10003005/09）“气溶胶暴露装置的研制及在结核病治疗中的应用”

①军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室 北京 100071

②青岛众瑞智能仪器有限公司 山东 青岛 266101

lij-s@163.com

李劲松，男，（1964- ），博士，研究员。军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室，从事生物气溶胶转化医学和吸入毒理的研究工作。