库尔勒香梨萼端黑斑病发病规律及生理变化的研究

吴玉鹏，赵晓梅

（1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100；2.新疆农业科学院生物质能源研究所，新疆乌鲁木齐830091）

库尔勒香梨萼端黑斑病发病规律及生理变化的研究

吴玉鹏1，赵晓梅2，*

（1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉831100；2.新疆农业科学院生物质能源研究所，新疆乌鲁木齐830091）

为了提高库尔勒香梨对萼端黑斑病的抗病性，先采用0.014%Ca、2.0 μL/L 1-MCP、0.014%Ca和2.0 μL/L 1-MCP相结合的方法处理库尔勒香梨果实，提高其抗病性；再反接入萼端黑斑病病原菌，研究常温条件下病斑的发病情况及生理活性的变化。试验结果表明，采前喷施0.014%液钙能够抑制库尔勒香梨果实萼端黑斑病病原菌的横向生长；采后2.0 μL/L 1-MCP处理可抑制果实呼吸强度，提高果实的PAL活性；（采前0.014%钙+采后2.0 μL/L 1-MCP）能够可以提高果实中的总酚含量，抑制纵向生长和果实乙烯的释放，延缓果实衰老；对照能使果实保持较高的β-1，3葡聚糖酶活性。

库尔勒香梨；萼端黑斑病；发病规律；生理变化

库尔勒香梨采后萼端黑斑病和黑心病是因为果实品质下降和缺钙引起的生理病害［1］，钙［2］和1-MCP［3］在提高果实品质、延缓果实衰老方面具有重要的作用。本试验在此基础上，先采用一定浓度的钙处理、1-MCP处理以及钙和1-MCP组合处理正常果实，再在这些处理和对照果实上反接入库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌，研究常温条件下病斑直径、病斑深度的发病情况及呼吸强度、乙烯释放量、总酚含量，PAL和β-1，3葡聚糖酶活性的变化，分析果实感病后生理活性的变化规律，从而筛选出抗病的处理条件，旨为库尔勒香梨的贮藏保鲜提供丰富的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

1.1.1试验材料

在巴州轮台县新疆农科院轮台国家果树资源圃王德福果园进行。在库尔勒香梨座果2周～6周内，每隔1周采用0.014%液钙肥喷洒树体叶片1次，以清水为对照，喷施3次。单株小区，重复3次。

1.1.2试验试剂

乙醇、硼砂、硼酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、乙二胺四乙酸（EDTA）、β-巯基乙醇、L-苯丙氨酸、浓盐酸、冰醋酸、无水醋酸钠：均为分析纯试剂；

液钙肥：由北京雷力有限公司提供；1-MCP：由武汉远城发展有限公司提供；MAP采用聚乙烯（PE）材料：由新疆巨合科技有限责任公司提供。

1.1.3仪器设备

移液枪、Telaire 7001二氧化碳分析仪：北京宝云兴业科贸有限公司；FK-A组织捣碎机：常州翔天实验仪器厂；HH-S4数显恒温水浴锅：江苏金坛金伟实验仪器厂；CP214电子天平（Max：210 g，d=0.000 1 g）：奥豪斯仪器（上海）有限公司；电子天平（Max：10 kg，e=5 d，d=1 g）、80-1电动离心机、FCD-270SC N海尔冰柜、DHG-9240A电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；78HW-1磁力搅拌器：常州翔天实验仪器厂；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；气象色谱仪（主机：日本岛津2014C；工作站：GCsolution）。

1.2试验处理

1.2.11-MCP处理

采前喷钙和对照果实采摘后立刻运回实验室，剔除病果和烂果，挑选成熟度一致、大小一致的果实，预冷24 h。将喷钙和对照果实（各15 kg）放入由PE膜（厚0.1 mm）制成的1 m3密封帐中，将2片1-MCP片剂放入50 mL烧杯中，放入PE帐内，加入50 mL无离子水，轻摇，迅速密封PE帐，其产生的1-MCP量为2.0 μL/L，在25℃条件下，熏蒸7 h～8 h后，揭开PE帐，通风30 min。

表1　试验处理Table 1Experimental treatment

1.2.2各处理接种库尔勒香梨采后萼端黑斑病病原菌

首先将库尔勒香梨萼端黑斑病病原菌制成孢子悬浮液（1×106个孢子/mL），从4个处理中选取相同量的果实，分别用75%酒精擦洗3遍，然后用灭菌铁钉沿果实赤道线对称位置刺2个直径3 mm、深度4 mm的小孔，用移液枪吸取30 μL菌液打入伤口，使用透明胶带将孔的四周全部密封，形成一个密闭的内环境。置于常温（25℃，70%～80%RH）避光环境下，12 h后，进行各指标初值的测定。

每隔4天，测定果肉细胞的病斑直径、病斑深度、呼吸强度、乙烯、总酚含量、PAL活性、β-1，3葡聚糖酶活性。

1.3测定指标及方法

1.3.1病斑直径及深度

用直尺在病斑处进行十字交叉法测量病斑直径，再沿着接种处将果实横向切开，用直尺测量病斑深度，每个处理重复3次，单位cm。

1.3.2呼吸强度

用Telaire 7001二氧化碳分析仪测定果实呼吸强度，每处理重复3次。

1.3.3乙烯

1.3.3.1标准曲线的制作

取300 mL样品瓶，倒置，将氮气导管伸入瓶中充分通气，将瓶中空气排出。经长时间排气后，用橡胶塞密封瓶口。再往样品瓶中注射一定量的标准乙烯，分别配制含量为0、5、10、15、20（μL/L）的乙烯气体，充分摇动。然后用注射器从容器橡胶塞上取1.0 mL气体，在气相色谱仪上进样测定，确定乙烯出峰时间，以峰面积为横坐标、乙烯浓度为纵坐标制作标准曲线。

1.3.3.2色谱条件

氢火焰离子检测器：FID；色谱柱：GSBP-inowaxms弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；进样口温度：100℃，检测器温度：120℃，柱温：40℃，进样量：1 mL。分流比：30∶1；H2流速：50 kp（kp即皮托管系数）；气流（Air）流速：50 kp；N2流速：50 kp。

1.3.3.3气体收集与测定

将玻璃容器打开，倒扣放置，使容器中气体与空气平衡。然后放入1 kg左右果实，在室温下密闭1 h。用注射器从容器橡胶塞取气口中顶空取1.0 mL气体，在气相色谱仪上测定。经色谱仪检测后得到色谱图，加载标准曲线后（面积外标法），经过微机处理，即可得到进样气体乙烯浓度（ppm；μL/L）。

式中：C为气相色谱测定的样品气体中乙烯含量，μL/L；V为玻璃容器密闭空间的容积，mL；t为测定时间，h；W为果实重量，kg。

1.3.4总酚［4］

1.3.4.1酚类物质的提取

取10个梨果实，在果实的相同部位取组织块2.5g，共25 g，加入50 mL无水乙醇，加入25 mL 10%三氯乙酸，高速离心机10 000 r/min匀浆2 min，然后用10%三氯乙酸定容到100 mL，静置24 h，8 000 r/min离心15 min，沉淀用1 mol/LNaOH洗涤3次，收集上清液混匀，用盐酸调整溶液的pH到8.0，供非水溶性酚类物质测定。

1.3.4.2制作标准曲线

取6支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL（100μg/mL）标准没食子酸溶液，加水至1mL。加入3mL 0.1 mol/L的Folin试剂后混匀，再加入1 mL碱试剂，充分混匀，50℃水浴保温15 min，然后在650 nm波长处比色，以没食子酸含量为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4.3样品测定

取适当稀释的样品液1 mL，加入3 mL Folin试剂和1 mL碱液，测定过程与标准曲线制作相同。

1.3.5苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［4］

1.3.5.1酶液制备

称取5.0 g果实组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、8 000 r/min离心30 min，收集上清液，即为粗酶提取液，低温保存备用。

1.3.5.2活性的测定

取两支试管，分别加入3.0 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸缓冲液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸。向一支管中加入0.5 mL酶提取液，另一支管中加入0.5 mL经煮沸5 min失活酶液作为对照。然后，将两支反应管置于37℃保温60 min。保温结束时立即向两支反应管中分别加入0.1 mL 6 mol/L盐酸溶液终止反应。以蒸馏水为参比空白调零，分别测定样品反应管和对照反应管中溶液在波长290 nm处的吸光度值（ODS和ODC）。重复3次。以每小时每克鲜重（FW）组织反应体系吸光度值增加0.01时为1个PAL活性单位（U），表示为0.01△OD290·h-1·g-1FW。

式中：ODS为样品管反应溶液的吸光度值；ODC为对照管反应溶液的吸光度值；V为样品提取液总体积，mL；VS为测定时所取样品提取液体积，mL；t为酶促反应时间，h；W为样品重量，g。

1.3.6β-1，3葡聚糖酶（GLU）活性［4］

1.3.6.1酶液提取

称取10.0 g果实组织样品，置于研钵中，加入10 mL经预冷的提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、8 000 r/min离心30 min，收集上清液，低温保存备用。

1.3.6.2活性测定

取两支反应管，分别加入100 μL 0.4%的昆布多糖溶液。然后，向一支管中加入100 μL酶液，向另一支管中加入100 μL经煮沸5 min的酶液作为对照，混匀。将反应管置于37℃保温40 min。保温后向反应管中加入1.8 mL蒸馏水和1.5 mL DNS试剂，在沸水浴中加热3 min。再用蒸馏水将显色的反应液稀释至25 mL，混匀。测定混合液在540 nm处的吸光度值。重复3次。

式中：C为从标准曲线查得的葡萄糖量，mg；V为样品提取液总体积，mL；VS为测定时所取样品提取液体积，mL；t为酶促反应时间，s；W为样品重量，g；180为葡萄糖相对分子质量。

1.4数据分析

应用Excel 2010软件制作曲线图。

2　结果与分析

2.1果实病斑直径的变化

病斑直径能够从横切面角度反映出病斑面积的大小，因而可作为判断病害危害程度的重要指标，见图1。

图1　接种后库尔勒香梨病斑直径的变化Fig.1Changes of lesion diameter of Korla fragrant pear after inoculation

各处理库尔勒香梨果实接种萼端黑斑病病原菌后，各处理的病斑直径都呈不断上升的变化趋势，按照大小顺序排列依次为：处理2＞处理3＞处理4＞处理1，说明处理1，即采前采用0.014%液钙喷施库尔勒香梨树体，能更好地抑制果实萼端黑斑病病原菌的横向生长。

2.2果实病斑深度的变化

病斑深度能够从纵切面角度反映出病斑侵入果实内部的深度，因而可作为判断病害危害程度的重要指标，见图2。

图2　接种后库尔勒香梨病斑深度的变化Fig.2Changes of lesion depth of Korla fragrant pear after inoculation

随着时间的延长，各处理库尔勒香梨果实接种萼端黑斑病病原菌后，各处理的病斑深度逐渐增加，按照大小顺序排列依次为：处理3＞处理4＞处理1＞处理2，处理2即采前采用0.014%液钙喷施库尔勒香梨树体，结合采后2.0 μL/L 1-MCP处理，能更好地抑制果实萼端黑斑病病原菌纵向生长。

2.3果实呼吸强度的变化

呼吸作用是果蔬采收后进行的生理活动，呼吸强度可反映呼吸作用的强弱，果实感病后呼吸强度会显著增加，见图3。

图3　接种后库尔勒香梨呼吸强度的变化Fig.3Changes of respiration rate of Korla fragrant pear after inoculation

处理1、处理2和处理3果实的呼吸强度都在第5天达到呼吸高峰，分别为15.90、10.56、7.19 mg/（kg·h），按照呼吸强度的高低排列：处理1＞处理2＞处理4＞处理3。

2.4果实乙烯释放量的变化

乙烯能促进果实的后熟衰老过程。通过收集各处理果实释放的乙烯样品，利用气相色谱法测定乙烯浓度，计算乙烯释放量，见图4。

图4　接种后库尔勒香梨乙烯释放量的变化Fig.4Changes of ethylene production of Korla fragrant pear after inoculation

各处理果实乙烯的释放量变化一致，都在第1天下降，3天后急剧上升，第5天达到峰值，之后又开始迅速下降。按照乙烯释放量大小的顺序排列：处理4＞处理1＞处理3＞处理2。

2.5果实PAL活性的变化

苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物生长发育和抵御病害方面起着重要的作用，见图5。

图5　接种后库尔勒香梨PAL活性的变化Fig.5Changes of phenylalamine ammonia lyase activity of Korla fragrant pear after inoculation

处理1和处理3果实的PAL活性变化一致，初期都是先逐渐下降，分别在第9天和13天达到最低值，之后又迅速上升；和处理2和处理4相比，处理1和处理3果实的PAL活性较高，其中处理3能更好地推迟谷值的来临，使PAL活性保持在较高的水平，因而抗病性也较强。

2.6果实GLU活性的变化

当植物体被外界微生物侵染时，β-1，3葡聚糖酶活性会显著提高，用来增强植物体的抗逆性，见图6。

图6　接种后库尔勒香梨GLU活性的变化Fig.6Changes of β-1，3-glucanase activity of Korla fragrant pear after inoculation

整个贮藏期内，除处理3外，其它处理果实的β-1，3葡聚糖酶活性均呈现峰值的变化，并且都是在第9天达到高峰，按照活性高低的顺序排列：处理4＞处理1＞处理3＞处理2，该顺序与乙烯释放量的一致，说明处理4果实对病害的抵抗能力较强。

2.7果实总酚含量的变化

植物多酚是植物体内重要的次生代谢物质。极端环境下，植物通过形态变化和次生代谢物质等来抵御极端环境胁迫，见图7。

图7　接种后库尔勒香梨总酚含量的变化Fig.7Changes of phenolic content of Korla fragrant pear after inoculation

各处理果实的总酚含量均呈现峰值的变化。处理2果实中的总酚含量是在第13天达到高峰，其它处理都在第9天达到高峰。总酚含量的高低排序：处理2＞处理3＞处理1＞处理4，说明采前喷施0.014%液钙结合采后2.0 μL/L 1-MCP处理，能更好地提高次生代谢物质-酚类物质含量，使果实能够增强抵御病害的能力。

3　讨论

采前喷施0.014%液钙能够抑制果实萼端黑斑病病原菌的横向生长；采前喷施0.014%液钙，结合采后2.0 μL/L 1-MCP处理可抑制病原菌纵向生长及果实乙烯的释放，提高贮藏后期果实的总酚含量；采后2.0μL/L 1-MCP处理能更好地抑制果实的呼吸强度，提高果实的PAL活性；而处理4（CK）果实中的β-1，3葡聚糖酶活性最高，抵抗病害侵染的能力较强。1-MCP处理能明显抑制果实的呼吸作用，这与‘绿宝石’梨［5］、黄金梨［6］上的研究结果一致。1-MCP处理能明显降低果实的呼吸强度和乙烯释放量以及果皮和果肉组织的总酚含量，与1-MCP在酥梨［7］、黄金梨［6］、秀丰梨［8］、鸭梨［9］上的结论不完全一致。与吴爱现等［10］的1%和3%的浸钙处理，均可降低丰水梨果实贮藏期间呼吸强度研究结果不一致。

4　小结

1）采前喷施0.014%液钙能够抑制库尔勒香梨果实萼端黑斑病病原菌的横向生长；

2）处理3（采前0.014%钙+采后2.0 μL/L 1-MCP）可以提高果实中的总酚含量，抑制纵向生长和果实乙烯的释放，延缓果实衰老；

3）采后2.0 μL/L 1-MCP处理可抑制果实呼吸强度，提高果实的PAL活性；

4）处理4（CK）能使果实保持较高的β-1，3葡聚糖酶活性。

［1］贾晓辉，王文辉，李世强，等.库尔勒香梨萼端黑斑病发生的原因［J］.果树学报，2010，27（4）：556-560

［2］陈婷，黄新忠，刘鑫铭，等.钙处理对黄花梨主要贮藏品质指标的影响［J］.福建农业学报，2012，27（7）：728-733

［3］王文生，陈存坤，冯炯琦，等.气调贮藏对新疆厚皮甜瓜采后生理及贮藏效果的影响［J］.农产品加工，2008（4）：67-69

［4］曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导［M］.北京：中国轻工业出版社，2007：101-102

［5］孟坤，董宇，刘立芹，等.1-MCP对‘绿宝石’梨采后成熟衰老期间H2O2含量及其相关酶活性的影响［J］.河北农业大学学报，2011，34（5）：27-31

［6］王文辉，王志华，佟伟，等.1-MCP处理对黄金梨采后生理及保鲜效果的影响［J］.保鲜与加工，2009（1）：30-34

［7］王宝亮，王文辉，姜云斌，等.1-MCP处理对不同产地酥梨低温贮后货架期防褐保鲜效应的研究［J］.保鲜与加工，2014，14（5）：24-30

［8］王淑贞，杨雪梅，张元湖，等.1-MCP处理对梨贮藏品质及抗氧化活性的影响［J］.中国食物与营养，2011，17（9）：47-50

［9］朱文嫱，张秀玲，王娟，等.1-MCP处理对鸭梨常温贮藏品质及生理指标的影响［J］.食品工业科技，2014（2）：296-299

［10］吴爱现，周莎莎，张晶，等.不同浓度钙处理对丰水梨保鲜效果的影响［J］.北方园艺，2010（1）：193-195

Study on the Occurrence Regularity of Calyx End Black Spot and Physiological Changes in Korla Fragrant Pear

WU Yu-peng1，ZHAO Xiao-mei2，*
（1.Xinjiang Vocational College of Agriculture，Changji 831100，Xinjiang，China；2.Research Institute of Bioenergy，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，Xinjiang，China）

In order to improve the disease resistance to calyx end black spot of Korla fragrant pear，the test used 0.014%Ca，2.0 μL/L 1-MCP and Ca 0.014%combined with 2.0 μL/L 1-MCP to deal with Korla fragrant pear for improving the disease resistance.It studied the onset of disease spot under the condition of normal temperature and the change of physiological activity when accessed the calyx end black rot pathogen again.The test results showed that spraying 0.014%calcium preharvest could inhibit the Korla fragrant pear fruit calyx end black rot pathogen lateral growth；2.0 μL/L 1-MCP postharvest treatment inhibited the fruit respiration intensity and improved the PAL activity of the fruit；（Spraying 0.014%calcium preharvest+2.0 μL/L 1-MCP postharvest treatment），could improve the total phenol content in fruit and inhibited the growth of longitudinal and ethylene release，fruit senescence；Contrast could make the fruit to keep high beta 1，3 glucanase activity.

Korla fragrant pear；calyx end black spot；occurrence regularity；physiological changes

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.043

2015-10-18

自治区财政林业科技专项资金项目“采前喷钙对库尔勒香梨黑心病控制技术的推广与示范”

吴玉鹏（1979—），男（汉），讲师，硕士，主要从事果树、蔬菜栽培方面的研究。

赵晓梅（1980—），女，副研究员，博士，主要从事果树学方面的研究。