没食子酸乙酯对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力及其作用机制研究

黄丽英　陈夏

福建省肿瘤医院乳腺外科，福州　350014

没食子酸乙酯对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力及其作用机制研究

黄丽英陈夏#

福建省肿瘤医院乳腺外科，福州350014

目的研究没食子酸乙酯（EG）对高转移性乳腺癌细胞株黏附、侵袭和迁移能力影响及其作用机制。方法观察EG干预后高转移性乳腺癌MDA-MB-231与对照组相比黏附、侵袭、迁移能力的变化，采用SABC法和实时PCR法检测EG对丝/苏氨酸激酶（AKT-2）和eIF-4E的蛋白表达及mRNA表达的影响。结果加入EG干预的高转移性乳腺癌细胞株的黏附、侵袭和迁移能力均低于对照组（P＜0.05）；EG组的AKT-2和eIF-4E蛋白表达及mRNA表达量均低于对照组，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论体外EG能降低MDA-MB-231的侵袭能力，可能与抑制癌细胞中原癌基因和延长因子蛋白以及mRNA的表达有关。

没食子酸乙酯；MDA-MB-231细胞；AKT-2；eIF-4E

Oncol Prog，2016，14（4）

由于乳腺在生理位置和解剖构造上的特殊性，乳腺癌细胞易脱落，并伴随血液和淋巴液转移至全身各处，从而对患者生命造成威胁。2012年公布的数据显示，乳腺癌已经成为我国女性恶性肿瘤发病率之首，所以提出有效的乳腺癌治疗方案是目前妇科临床工作研究的重点［1-3］。没食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）是狼毒大戟（euphorbia fischeriana steud）的主要成分之一，多项研究表明其对多种肿瘤均具有抑制作用，在前期研究中，应用了MTT法对3株具有不同转移能力的乳腺癌细胞进行了筛选，发现EG对高转移能力的乳腺癌MDAMB-231细胞生长抑制作用最为显著［4］。因此，本文通过EG对体外培养的MDA-MB-231细胞株黏附、侵袭和转移三个方面的影响进行研究，探讨EG对乳腺癌治疗的积极作用，从而为以后的继续研究提供参考价值。

1　材料与方法

1.1主要实验试剂

EG由福建省肿瘤医院研究室自主提炼。高转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自上海研域生物科技有限公司，基质膜购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Chemicon公司；实时PCR试剂盒、反转录试剂盒、Trizol细胞提取液购自美国TIANGEN公司，SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自上海瓦蓝生物科技公司。引物序列由福建省生物技术研究所合成。

1.2细胞培养

将高转移性乳腺癌细胞株离心后置入含10% FBS的高糖DMEN培养基的培养板中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中按1∶3传代培养。通过显微镜下检测细胞生长和细胞活性直至达到实验要求。

1.3细胞与基质胶黏附实验［5］

使用基质胶和20 μg/ml纤维粘连蛋白将96孔细胞培养板制成与人体细胞基质类似的黏附实验板，将培养好的高转移性乳腺癌细胞株消化离心成单细胞悬液并清洗完毕后，接种于装有1 ml完全培养基的12孔板中，每孔1×105个细胞。分成两组，分别加入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）1 m（l对照组）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG组）后，两组均加入含有5 μg/ml的DiI染色液1 ml。培养并染色完成后，分别加入细胞黏附实验板中，1 h后置于镜下观察细胞黏附情况，计算黏附细胞平均值。

1.4细胞与基质膜侵袭实验［6］和迁移实验

按照说明要求使用Transwell小室制作细胞侵袭基质膜实验装置，将培养好的MDA-MB-231消化离心成单细胞悬液并清洗完毕后，接种于装有1 ml完全培养基的12孔板中，每孔2×105个细胞。分成两组，分别加入PBS缓冲液1 m（l对照组）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG组）后，分别放入实验装置中，培养36 h。结束后，取出Transwell小室，擦去上室内的细胞和聚碳酸酯膜上的基质胶，使用结晶紫染液染色，并用33%CH3COOH溶解脱色，洗脱液在酶标记仪OD值等于570 nm处测量，通过穿膜细胞数量反映MDA-MB-231的侵袭情况。

迁移实验原理与侵袭实验类似，可以重复利用侵袭实验中擦去基质胶的聚碳酸酯膜，避免浪费。

将在12孔板中培养好的高转移性乳腺癌细胞分成两组，分别加入蒸馏水1 m（l对照组）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG组），再加入一抗、二抗后滴加显色剂观察并记录。

将在12孔板中培养好的高转移性乳腺癌细胞分成两组，分别加入PBS缓冲液1 m（l对照组）和含有5 μg/ml的EG溶液1 m（lEG组），培养24 h后，使用Trizol细胞提取液提取RNA，离心后使用PCR法进行反转录，成像后镜下观察并记录，引物序列参考崔红霞等［5］的研究（表1）。

表1　引物及其序列和长度

1.7统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。细胞黏附数、测量值、AKT-2水平等计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EG对细胞黏附能力的影响

MDA-MB-231进行黏附1 h后，镜下可以观察到被DiI染色的细胞呈红色，通过图1可以看出，EG组细胞黏附数量明显低于对照组。两组细胞黏附计数结果显示，对照组细胞黏附数为（142.19± 4.48），高于EG组的（79.36±5.27），两组差异具有统计学意义（P=0.024）。

图1　两组的细胞黏附情况（荧光探针DiI染色，×200）

2.2EG对细胞侵袭能力的影响

在Transwell小室中培养36 h后，镜下观察被结晶紫染液染色的高转移性乳腺癌细胞和对比酶标记仪OD值等于570 nm处的测量结果发现，EG组细胞的侵袭能力明显低于对照组（图2）。两组OD值等于570 nm处的测量结果显示，对照组测量为（0.672±0.026），EG组测量为（0.309±0.057），两组比较差异具有统计学意义（P=0.001）。

2.3EG对细胞迁移能力的影响

图2　两组的细胞侵袭情况（结晶紫染色，×200）

在Transwell小室中培养24 h后，对比酶标记仪OD值等于570 nm处的测量结果发现，对照组和EG组的测量结果分别为（0.628±0.129）和（0.359± 0.213），说明EG组细胞的迁移能力低于对照组，两组比较差异具有统计学意义（P=0.041）。

镜下观察结果显示，EG组两种蛋白的表达明显被抑制（图3）。两组蛋白表达量对比结果显示，EG组AKT-2表达量为（0.394±0.152），低于对照组的（0.835±0.173），两组对比差异具有统计学意义（P=0.035）；EG组eIF-4E表达量为（0.296±0.148），低于对照组的（0.649±0.281），两组对比差异亦具有统计学意义（P=0.018）。

镜下观察结果显示，EG组的两种mRNA表达明显被抑制（图4）。两组mRNA表达结果对比显示，EG组AKT-2表达量为（0.401±0.208），低于对照组的（0.928±0.914），两组比较差异具有统计学意义（P=0.003）；EG组eIF-4E表达量为（0.328± 0.301），低于对照组的（0.736±0.197），两组比较亦有统计学意义（P=0.009）。

图4　EG对AKT-2和eIF-4E的mRNA表达检测

3　讨论

目前，乳腺癌发生转移仍是影响预后的重要原因，在肿瘤的转移过程中，肿瘤细胞及细胞外基质的黏附、侵袭及迁移运动是转移到远处器官的关键性步骤。

通过多年来的探索，发现原癌基因（AKT-2）［7］和延长因子（eIF-4E）［8］在乳腺癌细胞转移过程中起到了重要的作用。AKT-2是AKT家族中唯一与乳腺癌有关的蛋白激酶，它可使乳腺癌细胞变大、细胞核增加。在细胞转移时，AKT-2可以通过表达使细胞与胶原蛋白的结合能力增加，从而加速细胞的黏附能力和侵袭能力，这说明AKT-2在癌细胞转移过程中可以聚合整合素β-1，所以AKT-2可以在临床上对乳腺癌的转移检测起到重要的标志作用。延长因子是近年来新发现的一种乳腺癌转移标志分子，病变细胞中的表达比在正常乳腺细胞中高5～25倍，eIF-4E通过提高癌基因的特异性转录活性，达到改变细胞形状，加速细胞增殖和促进细胞转移的作用。eIF-4E可以联合VEGF、cyclinD1和MMP-9共同促进肿瘤血管的形成，为癌细胞的活力提供保证，帮助癌细胞降解基底膜从而侵入临近血管和淋巴，加速转移进程，目前临床已将eIF-4E作为乳腺癌复发的标志。没食子酸乙酯是在狼毒大戟中提取的有效成分，多项研究表明其体外可显著对MDA-MB-231细胞的侵袭、运动和黏附能力进行抑制，并能够从多个环节抑制乳腺癌细胞的体外侵袭能力［9］。

本研究中，通过观察体外培养的高转移性乳腺癌细胞对Matrigel基底膜的黏附，Transwell小室中癌细胞的侵袭和迁移实验，研究EG对细胞黏附能力、迁移能力、侵袭能力的影响，发现经过EG干预的癌细胞黏附和运动能力下降，这说明在体外使用EG可以有效地影响乳腺癌细胞的转移，由于AKT-2和eIF-4E在癌细胞转移中具有重要作用，通过分析又得出，在癌细胞转移时EG可以降低以上两种因子的表达，说明EG在体外可以抑制MDAMB-231的转移，这与EG可以降低细胞中AKT-2和eIF-4E的蛋白和mRNA表达有关，但是否还有其他影响因素还需进一步研究观察。吴玉等［10］研究结果中显示，EG还可降低MDA-MB-231细胞中MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA水平，因而抑制了细胞外基质降解，并阻止了肿瘤细胞侵袭。

综上所述，体外EG能降低MDA-MB-231的侵袭能力，这可能与抑制癌细胞中原癌基因和延长因子蛋白以及mRNA的表达有关。另外，本研究内容方面可能较局限，还需在今后的研究中开展多方面研究，以进一步扩大研究内容，提高研究结果的科学性。

［1］李泰霖，谢海棠，许标波，等.AS-PCR检测ABCG2 34G＞A多态性［J］.中国临床药理学与治疗学，2014，19（10）: 1111-1115.

［2］郭玉娥，李静.宫颈癌超声诊断与MMP-1蛋白表达的相关性［J］.中国妇幼保健，2014，29（1）:136-138.

［3］王英，刘翔宇，谌永毅.信息需求评估和信息支持对乳腺癌患者康复效果的影响［J］.中国现代医学杂志，2014，24（20）:89-93.

［4］肖宇，雷玉涛，赵红梅，等.41例双侧原发性乳腺癌的临床病理特征分析［J］.现代肿瘤医学，2014，22（12）:2859-2863.

［5］崔红霞，王明，苑家鑫，等.没食子酸乙酯对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响及其机制［J］.药学学报，2015，50（1）:45-49.

［6］王雅蕾，张尚荣，王一凡，等.人源电压门控质子通道对乳腺癌细胞迁移与侵袭的影响［J］.中国肿瘤临床，2013，40（17）:1025-1028.

［7］唐晓林，李瑶，杨永秀.原癌基因Bmi-1在肿瘤形成中的研究进展［J］.中国临床研究，2014，27（11）:1418-1420.

［8］夏伟兰，张广亮，刘志勤.eIF-4E和Ki67在子宫内膜异位症中的表达及其临床意义［J］.分子影像学，2014，37（4）: 225-228.

［9］刘莉萍，潘慧，魏亚，等.乳腺癌中ErBb原癌基因家族的蛋白表达与临床病理特征的关系［J］.中华全科医学，2014，12（4）:589-590；644.

［10］吴玉，卫红艳，翟琼莉.1，25（OH）2D3对成骨细胞增殖及其与乳腺癌细胞黏附的影响［J］.山东医药，2014，54（39）: 1-4.

The effect of ethyl gallate on the invasion ability of human breast cancer MDAMB-231 cells and the underlying mechanism of action

HUANG Li-ying CHEN Xia#
Department of Breast Surgery，Fujian Provincial Tumor Hospital，Fuzhou 350014，China

ObjectiveTostudytheeffectofethylgallate（EG）ontheadhesion，invasionandmigrationabilityofinhighly metastatic breast cancer cell line.MethodThe changes of adhesion，invasion and migration ability of MDA-MB-231 after EG treatment were observed，while SABC and real-time PCR were applied to detect the effect of EG on protein and mRNA expression of serine/threonine kinase（ATK-2）and eIF-4E.ResultThe adhesion，invasion and migration ability of highly metastatic breast cancer cell line with EG treatment was weaker than that without EG（P＜0.05），besides，the protein and mRNAexpression of AKT-2 and eIF-4E in EG group was lower than that in control group，with significant difference observed（P＜0.05）.ConclusionIn vitro EG treatment reduces the invasion ability of the MDA-MB-231 cancer gene，which may be related to the inhibited expression of proto-oncogene，elongation factor and mRNA.

EG；MDA-MB-231；AKT-2；eIF-4E

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.24

2015-08-05）

（corresponding author），邮箱：chenxia61@sina.com