海南鲜椰子水对酒精性肝损伤大鼠的保护作用研究*

周慧友，郑万玲，江成，许善虹，文婷，高凌峰

海南鲜椰子水对酒精性肝损伤大鼠的保护作用研究*

周慧友，郑万玲，江成，许善虹，文婷，高凌峰

目的探究海南鲜椰子水对酒精性肝损伤大鼠的保护作用。方法采用56°白酒灌胃，建立大鼠酒精性肝损伤模型。取大鼠26只，随机分为椰子水处理组9只，模型组9只和正常组8只。给予椰子组和模型组动物白酒灌胃，同时给予椰子组椰子水自由饮用，给予正常组动物0.9%生理盐水灌胃，给予模型组和正常组蒸馏水自由饮用，均连续29 d。采用硫代巴比妥酸法检测肝组织匀浆丙二醛（MDA）含量，采用羟胺法检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果在实验结束时，模型组动物血清AST水平为（123.0±36.2）U/L，显著高于正常组和椰子组【（86.5±21.0）U/L和（96.9±26.0）U/L，P＜0.05】，但不同组间血清ALT和TG水平差异无统计学意义（P＞0. 05）；模型组肝组织匀浆MDA含量为（0.479±0.069）nmol/mg，显著高于椰子组【（0.258±0.078）nmol/mg，P＜0.01】和正常组【（0.311±0.139）nmol/mg，P＜0.01】；椰子组和模型组SOD含量分别为（0.068±0.008）U/mg和（0.071± 0.010）U/mg，显著高于正常组【（0.044±0.022）U/mg，P＜0.05】，但椰子组与模型组SOD含量差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组大鼠肝细胞脂肪变性较轻，肝小叶中心带肝细胞中出现大小不等的脂肪滴，个别有肝淤血；椰子组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞结构完整、清晰。结论椰子水对酒精性肝损伤具有一定的保护作用，机理可能与其抗氧化作用有关。

酒精性肝病；椰子水；氧化应激；大鼠

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒所导致的肝脏疾病，主要包括轻症酒精性肝损伤（mild alcoholic injury，MAI）、酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）、酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）、酒精性肝纤维化（alcoholic hepatic fibrosis，AHF）和酒精性肝硬化（alcoholic cirrhosis，AC）［1］。据2014年WHO统计，全球范围有害使用酒精人群每年有约330万人死亡，占死亡人数的5.9%。在中国，随着国民经济的发展，人们生活方式、饮食习惯及饮食结构的改变，我国人群中嗜酒者的比例呈上升趋势，同时ALD患病率也不断增加［2］。最新研究发现，ALD发病机制主要与酒精及其代谢产物对肝脏的直接毒性作用、氧化应激反应、肠源性内毒素血症、Kupffer细胞活化、促炎因子释放、铁沉积等多种因素有关［3］。现今，一般只在戒酒基础上干预ALD患者，仍缺乏特殊有效的治疗方案［4］。椰子水是一种营养和保健价值很高的天然饮料，富含还原糖、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等营养物，同时椰子水中游离的氨基酸具有舒张血管功能［5-8］。此外，天然椰子水对超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）有较强的清除能力和还原能力，表明天然椰子水的抗氧化活性较强，具有保健作用［9，10］。针对酒精性肝病自由基发病机理，应用天然椰子水干预酒精对肝脏损伤的研究目前未见报道。本实验探究了椰子水对酒精性肝损伤的保护作用，以为其临床药物的开发应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物、试剂与仪器SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g（由湖南长沙市天勤生物技术有限公司提供，动物质量合格证编号：43006700005602）。椰子（海南高种绿椰［11］），56°红星二锅头酒（北京红星股份有限公司，批号：6906785230165）。检测天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、甘油三脂（TG）试剂盒、过氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；722型可见分光光度计（上海光学仪器一厂）；离心机（5810型，德国Eppendorf公司）；独立送风隔离笼具IVC（GA56型，苏州市冯氏实验动物设备有限公司）。

1.2酒精性肝损伤模型的制备取大鼠26只，适应性饲养1 w，随机分为椰子水处理组9只，模型组9只和正常组8只。按文献报道的方法［12，13］，每日下午6点测定体质量，模型组和椰子组给予白酒10 mL· kg-1·d-1灌胃，正常组给予0.9%生理盐水等剂量灌胃。在灌胃饲养期间，给予椰子组动物40 mL·d-1鲜椰子水自由饮用（大鼠生理需水量大约为40 mL· d-1［14］），给予正常组和模型组蒸馏水40 mL·d-1自由饮用，各组自由摄食，实验周期为29 d。于末次灌胃，禁食不禁水12 h后，给予3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）腹腔注射，腹主动脉取血，制备血清，取肝右叶制备10%肝组织匀浆。

1.3指标测定使用日立公司生产的7020型全自动生化分析仪检测血生化指标（南京建成生物工程研究所）；采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测肝组织匀浆MDA含量（南京建成生物工程研究所）；采用羟胺法检测肝组织匀浆SOD含量（南京建成生物工程研究所）。

1.4肝组织病理学检查处死大鼠后，迅速取肝左叶，置于10%福尔马林溶液中固定，送海南省药物安全性评价研究中心，行常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。

1.5统计学处理应用SPSS 22.0软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠血生化指标变化的比较椰子组血清AST水平显著低于模型组（P＞0.05，表1）。

表1　各组大鼠血清生化指标（±s）比较

表1　各组大鼠血清生化指标（±s）比较

与模型组比，①P＜0.05

只ALT（U/L）AST（U/L）TG（mmol/L）椰子组944.7±10.096.9±26.0①1.2±0.6模型组642.8±7.9123.0±36.11.1±0.4正常组840.4±9.886.5±21.00.9±0.3

2.2各组大鼠肝组织SOD和MDA水平比较椰子组肝组织MDA含量较模型组显著降低（P＞0.05，表2）。

表2　各组大鼠肝组织SOD和MDA水平（±s）比较

表2　各组大鼠肝组织SOD和MDA水平（±s）比较

与模型组比，①P＜0.01

只SOD（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）椰子组90.068±0.0080.258±0.078①模型组60.071±0.0100.479±0.069正常组80.044±0.0220.311±0.139

2.3各组大鼠肝组织形态学变化正常组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，形成肝细胞索，肝脏细胞形态规则（图1A）；椰子组大鼠肝小叶结构较正常，肝血窦间隙丰富，肝脏细胞形态规则（图1B）；模型组大鼠肝细胞脂肪变性较轻，肝小叶中心带肝细胞出现大小不等的脂肪滴，一些肝细胞核则被脂肪滴挤出偏位，肝淤血（图1C、D）。

图1　大鼠肝组织病理学变化（HE，400×）

3　讨论

酒精性肝损伤是多因素参与的一个复杂的病理过程，在病变过程中多种酶、自由基以及脂质过氧化反应均参与其发生发展。经口摄入的乙醇经上消化道吸收入血，90%以上经肝脏代谢。在肝细胞内，可经乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醇氧化系统（microsomal ethanol oxidizing system，MEOS）中的细胞色素P4502E1（CYP2E1）和过氧化氢酶系统进行氧化代谢，乙醇经过ADH代谢为乙醛，乙醛进一步经过线粒体中的乙醛脱氢酶2（ALDH2）和胞质中的乙醛脱氢酶（ALDH）代谢为乙酸［15，16］。其中，乙醇通过激活P4502E1（CYP2E1）可以产生乙醛和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），产生氧化应激反应（oxidative stress，OS）［17］，在这个过程中产生羟自由基（OH-）、超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）等ROS，导致体内谷胱甘肽（GSH）和SOD等抗氧化成分减少［18］。该过程生成的自由基可引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白和酶变性、DNA氧化修饰等一系列毒性作用，最终导致肝细胞坏死或凋亡［19］。

模型组血清AST含量升高，模型组大鼠肝细胞脂肪变性较轻，肝细胞胞质内可见大小不等的脂肪滴，其中个别也可观察到肝淤血，提示酒精性肝损伤模型基本被成功复制。

肝细胞受损时，ALT和AST从细胞内逸出，释放入血。血清ALT和AST活性升高，在一定程度上反映了肝细胞受损程度［20］。椰子处理组动物血AST水平比模型组显著下降，提示椰子水具有保护肝细胞的作用，减少了酒精性肝细胞的损伤。本研究模型动物血清ALT和TG水平升高不显著，我们认为可能与造模实验时间较短有关，未能证实椰子水对大鼠肝损伤后是否能降低血清ALT和TG含量。

椰子处理组动物肝组织SOD含量明显升高，提示椰子水具有提高机体抗氧化功能；模型组动物肝组织SOD含量也高于对照组，我们认为可能与代偿性增加有关。与椰子组和正常组相比较，模型组大鼠肝脏MDA含量显著增加（P＜0.05）。MDA作为膜脂质过氧化物最重要的终产物，其含量变化代表机体脂质过氧化程度，间接反映肝细胞膜受损轻重［21］，其对线粒体呼吸功能、丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等具有显著的抑制作用，可能进一步造成细胞能量代谢障碍，细胞功能受损和加重病理损伤发展［22］。鲜椰子水有减轻活性自由基介导的脂质过氧化反应，提高抗氧化系统能力，进而起到保护肝脏的作用。

综上所述，本实验应用鲜椰子水处理酒精性肝损伤大鼠，结果血清AST和肝组织MDA水平较模型组明显下降，证实了鲜椰子水对肝脏有保护作用，其机制与增强肝脏抗氧化功能有关。由于本实验指标有限，要证实海南鲜椰子水中具体成分对大鼠酒精性肝损伤的保护作用及其机制还需进行后续研究。

志谢：本项目在实施过程中得到海南医学院教务部、机能学实验室、海南省药物安全性评价中心老师的大力支持。在组织病理学检查方面，得到谢富生老师的无私帮助，在数据统计学处理方面，得到吴玲老师的无私帮助。在此，一并表示衷心感谢。

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（收稿：2016-03-20）

（本文编辑：陈从新）

Protective effect of Hainan fresh coconut water on alcoholic liver injury in rats

Zhou Huiyou，Zheng Wanling，Jiang Cheng，et al.
Clinical Medical College，Hainan Medical University，Haikou 571101，Hainan Province，China

ObjectiveTo investigate the protective effect of Hainan fresh coconut water on alcoholic liver injury in rats.MethodsHepatic injury in rats was induced by daily administration of white spirit with alcohol concentraion of 56%by gavage for 29 days.Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group（n=9），control group（n=8）and coconut water group（n=9）.The animals in control was given 0.9%saline and in experimental group was given alcohol plus Hainan fresh coconut water.At the end of the experiment，the rats were sacrificed and blood and livers were collected.The histopathological change in liver was revealed by HE staining and the levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG）in blood and the content of superoxidedismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）in hepatic homogenates were detected.ResultsSerum AST levels in model group was（123.0±36.2）U/L，significantly higher than that in control group［（86.5±21.0）U/L，P<0.05］or incoconut water group［（96.9±26.0）U/L，P<0.05］；there was no significant differences in serum ALT and TGlevels among the three groups（P>0.05）；the MDA level in model group was higher than that in control group or incoconut water group［（0.479±0.069）nmol/mg vs.（0.258± 0.078）nmol/mg and（0.311±0.139）nmol/mg，P<0.01 for both］；the SOD levels in coconut watergroup and model group were higher than in control group［（0.068± 0.008）U/mg and（0.071±0.010）U/mg vs.（0.044± 0.022）U/mg，P<0.05forboth］，buttherewasno difference in SOD level between coconut watergroup andmodelgroup；Mildfattydegenerationof hepatocyteswasobserved inmodelgroupandfat droplet were found from hepatocytes in centrilobular regionswithsomehepaticcongestion，however，the histologyincoconutwatergrouprevealedregular hepatic lobules withintactanddistincthepatocytestructure.ConclusionHainan fresh coconut water has certain protective effect against alcoholic liver injury in rats，and its antioxygenation might be involved in this process.

Alcoholic liver disease；Coconut water；Oxidative stress；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.015

2014年校级大学生创新基金资助项目（编号：HYCX2014051）；2015年海南省大学生创新基金资助项目（编号：20150081）

571101海口市海南医学院临床学院2012级临床医学专业本科1班

周慧友，男，22岁，临床医学本科专业四年级学生。E-mail：1099471639@qq.com

高凌峰，E-mail：630122650@qq.com