不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin的影响

戴园园，柏友萍，叶合双，许晓东，张 晶，崔建飞，李 萌，卓 颜

（池州学院体育学院，安徽池州 247100）

不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin的影响

戴园园，柏友萍，叶合双，许晓东，张 晶，崔建飞，李 萌，卓 颜

（池州学院体育学院，安徽池州 247100）

目的：探讨不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin表达的影响.方法：建模7周后，取32只高脂诱导的肥胖倾向大鼠，随机分为4组，每组8只，分别为安静对照组（OC）、低强度运动组（OL）、中强度运动组（OM）、高强度运动组（OH）.OL、OM、OH分别以15－18m／min、21－25m／min和28－32m／min以及坡度均为0°的强度运动，1h／d，5次／周，干预8周.8周后采集麻醉后大鼠血液及内脏脂肪组织，用qRT－PCR测脂肪组织Vaspin mRNA基因表达，免疫组化测脂肪组织Vaspin蛋白表达，ELISA测血浆Vaspin浓度.结果：8周不同强度运动干预后，大鼠体重、内脏脂肪重量、体脂率较OC均下降明显（P＜0.01），体重OL与OH差异显著（P＜0.05），OL的内脏脂肪重量和体脂率较OM、OH均有差异（P＜0.05、P＜0.01）；内脏脂肪组织Vaspin mRNA基因表达量OC与OH存有显著差异（P＜0.05）；OL、OM、OH的Vaspin蛋白表达较OC呈渐进式上升，强度越大，表达越明显；血浆Vaspin浓度OH较OC上调明显（P＜0.05）.结论：实施8周不同强度运动后，较好地降低了青春期肥胖大鼠体重、内脏脂肪重量和体脂率，运动强度越大，效果越显著.不同强度运动干预显著上调了Vaspin mRNA基因表达量、Vaspin蛋白表达及血浆Vaspin浓度，运动强度越大，上调幅度越明显.

运动强度；青春期肥胖；脂肪组织；Vaspin

超重和肥胖会给青少年生理功能带来诸多不良效应，肥胖学生的身体素质呈明显下降趋势［1］.脂肪组织不仅可以维持能量平衡，还可以分泌多种脂肪因子，这些脂肪因子在肥胖的发生发展中起着重要的作用［2］.丝氨酸蛋白酶抑制剂（Visceral adipose tissue－derived serine protease inhibitor，Vaspin）是日本学者Hida［3］于2005年从OLETF大鼠白色脂肪组织中发现的一种与肥胖密切相关的脂肪因子.近年来，对于Vaspin的研究较为普遍，但是它在肥胖个体中扮演着怎样的角色还没有取得一致的结论.运动能够较好地预防和对抗肥胖及与肥胖相关的代谢疾病，但运动对脂肪因子Vaspin的影响仍存在一些争议，有关不同强度运动对肥胖受试者Vaspin的作用尚且模糊，仍需进一步的研究.

本文通过对青春期肥胖大鼠实施不同强度运动，探讨对其内脏脂肪组织Vaspin mRNA基因表达、Vaspin蛋白表达及血浆Vaspin浓度的影响，为进一步了解Vaspin的生理机制提供参考.

1　材料与方法

1.1材料

实验对象为3周龄的雄性SD幼鼠（许可证号码：SCXK（沪）2012－0002，合格证号：2007000546402）110只，体重75.52±7.64g，清洁级.随机选取12只SD幼鼠作为对照组普通饲料喂饲，剩余幼鼠高脂饲料喂饲，自由饮食饮水.第一阶段4周采用高脂饲料喂饲（饲料成分：碳水化合物45.2%，脂肪16.2%，蛋白质18.8%）；第二阶段3周喂40%脂肪供能高脂饲料（配比g／100g：普通饲料54.6g，猪油16.9g，蔗糖14g，酪蛋白低，正式干预前进行2－3次／天适应跑台练习，训练3天.OL、OM、OH运动方式以Bedford［5］设计的运动动物模型为依据进行改进，坡度均为0°，采用循环训练法，周一、周四休息，5次／周，共干预8周.具体运动方案如表2.

1.3血浆Vaspin的采集与测定

干预8周后，将大鼠禁食12h，禁水6h.使用麻醉剂水合氯醛（8%）注射腹腔，在无菌状态下剖开腹腔，采集腹主动脉血，并迅速分离血浆，保存于－80℃冰箱待测Vaspin浓度.采用酶联免疫吸附试验测血浆Vaspin浓度，基本操作步骤如下：（1）取冻血浆于室温下均匀且充分解冻，从4℃冰箱取出Vaspin试剂盒于室温下平衡20min后，再从铝箔袋中取出预先包被的Vaspin板条，标准品孔设置为双孔，各加50μl的不同浓度标准品；（2）设样本孔为单孔，加10μl的待测样本，再加40μl的样本稀释液（空白孔除外）；（3）在标准品孔和样本孔中各加入100μl的辣根过氧化物酶（HRP）检测抗体（空白孔不加），反应孔用封板膜封住，置于37℃恒温箱孵育1h；（4）用自动洗板机重复洗板5次，设置为每次每孔注入350μl的洗液，浸泡1min；（5）每孔加入50μl的底物α和β，37℃避光温育15min；（6）每孔加入50μl的终止液，立即在双波长为450nm （620nm参比）的双波长中测定各孔的OD值.

在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，得出Vaspin回归方程y＝0.151x＋0.081.把方程代入Excel工作表中，得到相应的浓度值，此浓度值再乘以5为样本实际浓度.10.2g，预混料2.1g，麦芽糊精2.2g）.建立肥胖模型期间每天定时观察饮水量、饮食量和排泄量，每周定时测一次体重和身长.7周建模成功后（造模成功标准为肥胖组体重＞20%的对照组体重［6］），选取32只造模成功大鼠，随机分为4组，每组8只.对照组体重378.92±24.70（g），体长21.17±0.41（cm），肥胖成功体重标准为454.70（g），肥胖倾向组体重469.82±19.25（g），体长22.54±0.65（cm）.实验期间动物分笼喂饲，饲养房条件：温度18℃－22℃，湿度50%－70%，光照12h／天.所有幼鼠与饲料均购自中国上海斯莱克实验动物有限责任公司.本实验的主要试剂与仪器见表1.

表1　主要试剂与主要仪器

1.2运动方案设计与实施

造模成功大鼠32只，随机分入4组，每组8只.分别为静止对照组（OC）、低强度运动组（OL）、中强度运动组（OM）、高强度运动组（OH）.进食量每天均控制在28g／只.本次运动强度等级设计为高、中、

表2　具体运动时间与速度 m／min×min

表3　Vaspin标准品OD值和对应浓度值

1.4脂肪组织采集和Vaspin mRNA、蛋白表达的测定

1.4.1脂肪组织采集 取内脏脂肪组织（附睾及肾周围的脂肪组织），称脂肪重量，取部分脂肪组织置于Trizol中，保存于－80℃冰箱，待测Vaspin mRNA.每组中剩下2只，用麻醉剂水合氯醛溶液（8%）注射腹腔，麻醉成功后无菌状态下剖开腹腔，从左心室灌注甲醛溶液（4%），于右心耳流出，用来固定大鼠.取内脏脂肪组织置于甲醛和蔗糖混合溶液中（4%），固定2周测免疫组化.

1.4.2Vaspin蛋白表达测定 取固定后的少许内脏脂肪组织，加胶包埋至－20℃冰冻切片机内进行切片，切片机调至40um，然后将切好后的组织放入PBS溶液中，捞片至玻璃片上.操作步骤如下：过氧化氢与纯甲醇混合溶液浸泡30min→含0.3%Triton－x 100－PBS中浸泡60min→滴加小牛血清→室温孵育20min→擦干转入一抗（Vaspin）4℃孵育36h→常温下孵育2h→PBS溶液冲洗后擦干转入二抗孵育2h→擦干转入三抗室温孵育2h→擦干依次滴加A、B、C试剂，显色3－15min并观察显色→蒸馏水冲洗、脱水、透明、封片→转入显微镜下观察Vaspin在脂肪组织中的显色并采集图片.

1.4.3Vaspin mRNA测定 根据GenBank提供的SD大鼠Vaspin cDNA序列设计引物（具体如表4），委托上海生工技术有限公司合成.总RNA提取：总RNA是从浸泡于Trizol中的脂肪组织中提取出来，一定浓度的RNA通过反转录酶和随机的六聚体引物被反转录成cDNA.Vaspin基因由荧光定量PCR系统检测，2个单位的RT反应通过SYBR Green QPCR在26μl PCR中被放大.样本在序列检测器中孵育，当温度达到95℃并持续2min时产生一次预变，随后进行40次的PCR循环，每次循环条件分别是95℃持续15sec、60℃持续1min.Vaspin熔解曲线为Tm 82℃，温度间隔0.3℃，5sec／each.采用2－△△Ct法来进行相对定量，△Ct＝Ct（target）－Ct（β－Actin）；△△Ct＝△Ct（treated）－△Ct（control）.2－△△Ct表示剂量组目的基因的表达量为对照的倍数.

表4　大鼠内脏脂肪组织Vaspin mRNA引物序列

1.5统计方法

实验数据用SPSS 17.0数据软件包处理.实验结果以均数±标准差（M±SD）表示.采用单因素方差分析（one－way ANOVA）中的两两比较（LSD）对实验相关指标之间差异性进行检验，P＞0.05为无显著性差异，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有非常显著性.

2　结果

2.1不同强度运动后肥胖相关指标的变化

由表5得知：8周不同强度运动干预后，大鼠体重（麻醉后）、内脏脂肪重量、体脂率（体脂率＝内脏脂肪重量／体重×100%）较OC均下降明显（P＜0.01）；OL的内脏脂肪重量和体脂率较OM、OH均有差异（P＜0.05、P＜0.01）；体重OL与OH差异明显（P＜0.05）.其他指标虽有相应的变化，但各组之间无明显差异（P＞0.05）.

2.2不同强度运动后Vaspin mRNA的变化

由表6可知：8周不同强度运动后，OL、OM、OH组的Vaspin mRNA均较OC组呈进行式上升，OC与OH存有显著差异（P＜0.05）

2.3不同强度运动后内脏脂肪组织Vaspin的蛋白表达

内脏脂肪组织Vaspin蛋白表达采用免疫组化测定，用标记的特异性Vaspin抗体为一抗对脂肪组织内Vaspin抗原的分布进行组织和细胞原位检测.白色脂肪细胞类似于圆形或卵圆形，内有单一的大脂滴，占细胞体积的90%，细胞核位于细胞边缘.图A为脂肪细胞在尼氏染色切片上，脂滴被酒精和二甲苯溶解，细胞呈空泡状，胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，部分胞核呈锥形；图B为未加一抗（Vaspin）的免疫组化染色，细胞呈空泡状，胞核没有显示，胞质呈薄层线状，切片上没有明显着色.其他组加一抗（Vaspin）后免疫阳性反应表现为：OC组大鼠内脏脂肪细胞体积较大，着色较深，呈淡棕色，Vaspin蛋白表达呈阳性，表达较明显；OL、OM、OH组内脏脂肪细胞体积减小，免疫组化细胞染色较OC组深，呈棕黄色，Vaspin蛋白表达呈强阳性，表达较多，且随着运动强度的增加，内脏脂肪细胞颜色与表达量呈现进行式上调.

表6　不同强度运动后Vaspin mRNA的变化（M±SD）（n＝6）Table 6 Laboratory parameters change after different exercise intensity in Vaspin mRNA（M±SD）（n＝6）

注：A图常规染色（免疫组化，×200）；B图未加一抗（免疫组化，×400）；其他图滴加一抗（免疫组化，×400）

2.4不同强度运动后血浆Vaspin浓度的变化

由表7可知：8周不同强度运动后，血浆Vaspin浓度随运动强度的增大而上升，其中，OH较OC上调明显（P＜0.05）.

3　讨论

3.1不同强度运动对青春期肥胖大鼠肥胖指标的影响

表7　不同强度运动后血浆Vaspin浓度、Vaspin mRNA的变化（M±SD）（n＝6）Table 7 Laboratory parameters change after different exercise intensity in plasma concentration of Vaspin（M±SD）（n＝6）

运动能够有效降低体重，减少脂肪堆积.Levin BE［7］等实验结果显示：4周的跑台运动能够使肥胖大鼠的体重较对照组显著下调.日本爱知大学运动医疗中心提出：运动强度为40%－60%最大摄氧量（VO2max），每次运动2.5小时有较好地减肥效果.本实验室的研究结果也显示：60%－70%F.C.运动强度能有效降低体重、体脂肪，减肥减重效果明显［8－9］.美国运动医学会［10］明确建议：每个成年人每周至少进行5 次150min中等强度运动，或3次75min较大强度运动，或中等结合较大强度的运动.本次实验结果显示：8周不同强度运动干预后，大鼠体重、内脏脂肪重量和体脂率均呈现大幅度下降，且运动强度越大，减肥效果更明显.在人体减肥过程中，肥胖者由于脂肪的过度堆积导致心血管系统功能降低，体能下降，较大强度运动可能会引起剧烈的生理反应.本次研究过程中也发现，高强度运动组的肥胖大鼠疲劳出现的早，并伴随着强烈的抵触情绪，运动后较中低强度运动大鼠恢复速率慢.因此，肥胖者减肥健身选择中低强度的运动为宜.

3.2实施不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin的影响

3.2.1内脏脂肪组织Vaspin mRNA与Vaspin蛋白的影响 Vaspin是最近被识别的一种与肥胖相关的脂肪因子，具有重要的生理功能.Kloting等［11］在肥胖受试者的皮下及内脏脂肪组织中均检测到Vaspin mRNA，且与体脂率具有明显的相关性，而在正常受试者（具有较低体脂率特点）中却没有检测到.Gonz′alez等［12］对不同生理状态下的大鼠进行研究发现，大鼠Vaspin mRNA表达在出生后45天达到顶峰.动物实验表明［13］：运动可促使OLETF大鼠内脏脂肪组织Vaspin mRNA的表达下降，但具体的作用机制需进一步的论证.Youn等［14］研究指出，4周运动干预后，Vaspin mRNA水平明显上调.还有研究表明：体重、内脏脂肪重量和体脂率的降低对Vaspin mRNA的表达具有很好地预测效果.本次研究显示：8周不同强度运动显著降低了体重、内脏脂肪重量及体脂率，增加了Vaspin mRNA的表达，且运动强度越大，表达越强烈.Vaspin作为胰岛素敏感型的脂肪细胞因子，它的升高可能是短暂补偿机制的一种表现.Gonz′alez等［12］研究还发现，切除脑垂体后的大鼠Vaspin mRNA的表达显著低于控制组，该实验证实生长激素对于大鼠白色脂肪组织Vaspin mRNA的表达具有一定的刺激作用.从本次8周不同强度运动干预的结果中发现，Vaspin mRNA均呈现上升趋势，且明显高于正常对照组，这可能是因为本次实验对象正处于青春发育期，其垂体分泌的生长激素较为旺盛，这成为Vaspin mRNA上调的关键因素.

蛋白质的定性是探究疾病发生发展不可或缺的手段，为寻求治疗的新靶点提供可靠思路.Tan等［15］发现超重多囊卵巢综合症妇女网膜脂肪组织的Vaspin蛋白表达水平较对照组高.刘师伟等［16］发现肥胖女性脂肪组织Vaspin的蛋白表达明显增高，提示雌激素能刺激Vaspin蛋白的表达.本次研究通过不同强度运动对青春期雄性大鼠进行干预，其Vaspin蛋白表达较对照组呈上调趋势，提示不同强度运动可以通过调节脂肪细胞蛋白表达来对抗肥胖，且随着运动强度的增加，调节效果更明显.此外，Vaspin蛋白表达可能受到生长激素与性激素的双重刺激，从而导致Vaspin蛋白的上调.不同强度运动与激素是如何介导或调节青春期肥胖大鼠内脏脂肪组织Vaspin蛋白表达仍需进一步的研究.

3.2.2血浆Vaspin浓度的影响 Andreas Oberbach等［17］在研究运动与抗氧化剂对血浆Vaspin浓度的影响中发现：专业运动员、先前接受训练和没受过训练的受试者，血浆Vaspin浓度没有明显不同；剧烈运动和经过四周训练且未服用抗氧化剂的受试者，血浆Vaspin浓度明显下降.Martos－Moreno等［18］研究报道：在通过改变生活方式而导致体重下降后，Vaspin浓度没有任何变化.但是，Lee等［19］报道：肥胖儿童通过短期生活方式的改变而导致体重显著下降后，胰岛素抵抗和Vaspin水平显著降低.以上各研究结果之间为什么会出现差异仍然不清楚，可能是因为研究对象的年龄不同，不同的成长阶段会影响生长激素的分泌.据报道，生长激素水平能够强烈影响血浆Vaspin浓度［11］.本次研究显示：通过实施8周不同强度运动干预后，血浆Vaspin浓度均高于对照组，且随着运动强度的增大而呈高表达趋势.这可能是因为我们的研究对象正处于青春发育期，生长激素分泌旺盛，影响着血浆Vaspin表达规律和循环水平.

4　结论

实施8周不同强度运动干预后，显著降低大鼠体重、内脏脂肪重量、体脂率，运动强度越大，效果越明显.不同强度运动干预显著上调了Vaspin mRNA基因表达量、Vaspin蛋白表达及血浆Vaspin浓度，运动强度越大，上调幅度越明显.不同强度运动对于Vaspin的作用机制以及不同强度运动是如何介导或调节Vaspin来对抗肥胖仍需进一步研究.

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Effect of Different Exercise Intensity on Vaspin Adolescent Obesity in Rats

DAI Yuan－yuan， BAI You－ping， YE He－shuang， XU Xiao－dong，ZHANG Jing， CUI Jian－fei， LI Meng， ZHUO Yan
（Physical Education Institute，College of Chizhou，Chizhou 247100，China）

Objective：In order to investigate the effect of Vaspin adolescent obesity rats in different intensity exercise.Methods：High fat fed rat model after 7weeks，take 32obesity rats were randomly divided into 4 groups，8rats in each group，respectively，the control group（OC），low intensity exercise group（OL），moderate intensity exercise group（OM），high intensity exercise group（OH）.OL，OM，OH in animal treadmill running speed respectively for 15－18m／min，21－25m／min，28－32m／min，at an incline of 0 degrees，1h／day，5times／week，for 8consecutive weeks.Anesthetized rats blood and visceral adipose tissue after 8weeks，expression by qRT－PCR measurement of adipose tissue Vaspin mRNA，immunohistochemistry was used to measure the expression of Vaspin protein in fat cells，measurement of plasma Vaspin concentration by ELISA.Results：The 8week exercise intervention，body weight，visceral fat weight and FAT%in adolescent rats were significantly lower than OC（P＜0.01）；Body weight in OL and OH were different（P＜0.05）；OM，OH rats，visceral fat weight and FAT%were lower than OL（P＜0.05，P＜0.01）；In the Vaspin mRNA，the OC and OH groups were significant difference（P＜0.05）；The different intensity exercise prompted the expression Vaspin protein showed upward trend for OC，exercise intensity bigger and more obvious.In the concentration of plasma Vaspin，the level of OH was higher than OC（P＜0.05）.Conclusion：8weeks of exercises of different intensity significantly reduce body weight，visceral fat weight and FAT%，exercise intensity bigger and more obvious.Three different intensity exercise prompted the expression Vaspin mRNA，Vaspin protein in visceral adipose tissue of rat and the level of plasma Vaspin to show upward trend，exercise intensity bigger and more obvious.

Q44

A

1001－2443（2016）03－0289－06

10.14182／J.cnki.1001－2443.2016.03.015

2015－03－29

安徽省高校自然科学基金重点项目（No.KJ2013A138）.

戴园园（1989－），女，硕士，助教，研究方向：健身运动处方的生理机制.

引用格式：戴园园，柏友萍，叶合双，等.不同强度运动对青春期肥胖大鼠Vaspin的影响［J］.安徽师范大学学报：自然科学版，2016，39（2）：289 －294.

Key wods：exercise intensity；adolescent obesity；adipose tissue；Vaspin