响应面优化弹性蛋白酶酶解罗非鱼下脚料的工艺研究

瞿叶辉， 丁利君， 彭文媛， 刘珊珊， 黄金， 成晓玲

(广东工业大学 1.轻工化工学院；2.材料与能源学院，广东 广州 510006)



响应面优化弹性蛋白酶酶解罗非鱼下脚料的工艺研究

瞿叶辉1， 丁利君1， 彭文媛1， 刘珊珊1， 黄金2， 成晓玲1

(广东工业大学 1.轻工化工学院；2.材料与能源学院，广东 广州 510006)

以罗非鱼加工鱼片的下脚料鱼头、鱼骨、鱼尾等为原料，选用弹性蛋白酶对其水解，通过响应面进行分析并优化酶解条件.以水解度与多肽含量为指标，分别对酶浓度、温度、pH值、料液比、酶解时间等因素对弹性蛋白酶酶解罗非鱼下脚料水解效果的影响进行分析.结果表明,弹性蛋白酶水解罗非鱼加工下脚料的最佳条件为：酶浓度0.553mg/g，料液比1∶5、自然pH、温度41.94 ℃、酶解3.31h，在此条件下得到的水解度为18.09%，多肽含量为0.9mg/mL.

罗非鱼下脚料； 响应面分析； 弹性蛋白酶； 水解度； 多肽含量

罗非鱼属鲈形目(Perciformes)丽鲷科(Cichlidae)罗非鱼属(Tilapia), 在热带和亚热带地区广泛养殖, 营养价值高，素有“白肉三文鱼”、“21世纪的鱼”之称[1].中国罗非鱼养殖产量世界第一,2010年的产量达120万t，而全球罗非鱼产量接近300万t. 广东省是国内罗非鱼养殖范围最广、产量及出口量最高的省份[2].近年来随着我国罗非鱼鱼片的出口数量迅速上升,大量的罗非鱼下脚料随之产生，几乎占整条罗非鱼的54%,其中鱼头、内脏、鱼鳞、鱼骨和鱼皮分别占26.5%、6.8%、2.2%、16.5%和4.0%，而这些原料富含氨基酸、蛋白质和各种活性矿物质，可作为人类可利用的蛋白源和营养源[3-4].近几年来，国内外有不少对鱼类加工下脚料的综合利用的研究探讨，主要为通过酶法提取蛋白水解产物，积累了大量的技术经验，为综合利用开辟了新的途径[5-6].用酶水解的水产动物蛋白多肽用途广泛，需求量较大，市场前景广阔，因此对多肽的研究具有十分重要的意义，而鱼的下脚料及低值鱼为理想的优质蛋白来源，可用来做为水解蛋白多肽的原料[7-8].利用蛋白酶对罗非鱼下脚料进行水解的研究较多，主要是鱼鳞、鱼骨、鱼皮等，丁利君等人[9]用枯草杆菌蛋白酶酶解罗非鱼鱼糜，取得了很好的效果，曾世祥等人[10]筛选不同酶酶解罗非鱼下脚料，得到木瓜蛋白酶的酶解效果最好.本研究以罗非鱼下脚料为原料，选用弹性蛋白酶对其进行酶解，并利用响应面设计优化酶解工艺，为罗非鱼下脚料的综合利用提供了理论依据.

1　材料与方法

1.1材料与仪器

罗非鱼下脚料(鱼头、鱼骨、鱼尾等)，深圳联合水产发展有限公司提供；弹性蛋白酶(30U/mg)，南京奥多福尼生物科技有限公司；还原型谷胱甘肽标准品，sigma公司；浓硫酸，硼酸，盐酸，磷酸二氢钠，三氯乙酸，磷酸氢二钠，甲醛，百里酚酞，乙酸镁，氢氧化钠，中性红，无水乙醚等，均为分析纯.UV-1200型分光光度计，上海美谱达仪器有限公司.

1.2罗非鱼下脚料基本成分分析

(1) 水分含量测定：恒温干燥法(GB5009.3-2010).

(2) 脂肪含量测定：索士提取法(GB5009.6-2003).

(3) 蛋白质含量测定：凯氏定氮法(GB5009.5-2010).

(4) 灰分的测定：灰化法(GB5009.4-2010).

1.3水解度及多肽含量的测定

1.3.1水解度的测定

水解度的测定采用甲醛滴定法[11-12].

式中,V1为空白消耗NaOH溶液的体积(mL)；V2为滴定样品时消耗的NaOH溶液的体积(mL)；C为NaOH溶液的浓度(mol/L)；M为所取水解液的体积(mL).

1.3.2多肽含量的测定

参考鲁伟[13]、ChalamaiahM[14]等人的方法绘制标准曲线，测定多肽含量.由标准曲线得回归方程：Y=0.114X+0.003 216， R2=0.994.

1.4罗非鱼下脚料的酶解工艺

罗非鱼下脚料→清洗预处理→粉碎→高压蒸煮→弹性蛋白酶酶解→灭酶→离心→上清液.

1.5酶解条件的确定

选取酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH、料液比5个单因素，以水解度与多肽含量为考察指标，确定对酶解效果较显著的因素及水平.在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken-Design响应面优化设计，以水解度及多肽含量为响应值[15].

2　结果与分析

2.1罗非鱼下脚料基本成分分析

由表1可知，新鲜罗非鱼加工下脚料含有大量水分，达50.89%，蛋白质的质量百分比含量高达23.10%，说明罗非鱼下脚料是一种不可忽视的优质蛋白质资源，可应用于多肽产品的开发及利用.

表1　罗非鱼下脚料成分分析

2.2酶解罗非鱼下脚料的单因素试验

2.2.1酶浓度对酶解效果的影响

称取罗非鱼下脚料样品2g，100 ℃灭酶后冷却，然后分别配制0、10、20、30、50、70、100U/g7个梯度的酶溶液，在pH值7.8、温度25 ℃、料液比1∶5的条件下酶解2h，以水解度(DH)和多肽含量(PC)为指标，探讨不同酶浓度对酶解效果的影响.图1表明，当酶浓度从0到20U/g时，水解度与多肽浓度上升速度非常快，随着酶浓度的增加，水解度变化不大，多肽含量呈现下降的趋势.

图1　酶浓度对酶解效果的影响

2.2.2酶解时间对酶解效果的影响

称取样品2g，100 ℃灭酶后冷却，在酶浓度20U/g、pH值7.8、温度25 ℃、料液比1∶5的条件下，分别酶解0、1、2、3、5、7、10h，分析不同酶解时间对酶解效果的影响.从图2可看出，随着酶解时间的增加，在0～2h范围内，水解度和多肽含量均有所上升，当酶解时间超过2h后，多肽含量呈现稍微下降的趋势，而水解度在2h时达到最大值并趋于平衡.

图2　酶解时间对酶解效果的影响

2.2.3酶解温度对酶解效果的影响

称取样品2g，100 ℃灭酶后冷却，以酶浓度20U/g、pH值7.8、料液比1∶5为固定条件，分别在室温(22 ℃)、5、15、25、35、45、55 ℃的条件下酶解2h分析不同酶解温度对酶解效果的影响.从图3可知，在5～35 ℃范围内，水解度与多肽含量随着温度的升高而逐渐升高，当温度为45 ℃时，水解度达到最大，温度在35～55 ℃时，多肽含量较高且稳定.

图3　酶解温度对酶解效果的影响

2.2.4pH对酶解效果的影响

称取样品2g，100 ℃灭酶后冷却，以酶浓度20U/g、温度25 ℃、料液比1∶5为固定条件，分别在pH为自然(7.3)、4、5、6、7、8、9的条件下酶解2h，研究不同pH环境对酶解效果的影响.由图4可以看出，随着初始pH值的增加，水解度和多肽含量呈现先增大后减小的趋势，在自然pH时达到最大.

图4　pH对酶解效果的影响

2.2.5料液比对酶解效果的影响

称取样品2g，100 ℃灭酶后冷却，以酶浓度20U/g、温度25 ℃、自然pH为固定条件，分别在料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10的条件下酶解2h，探讨不同料液比对酶解效果的影响.图5表明，随着料液比的增大，对酶解效果影响不大，虑到能源以及经济等因素，选择1∶5的料液比作为酶解条件的最优料液比.

图5　料液比对酶解效果的影响

2.3响应面试验结果与分析

综合单因素试验结果，选择酶浓度、温度、时间对酶解效果有显著影响的因素，进行Box-Behnken-Design响应面优化设计，如表2，并获得试验结果如表3.采用Design-Expert对试验结果进行方差分析(ANOVA)，利用Design-Expert8.0.6软件对表3的结果进行多元回归拟合分析，得到响应的回归方程为：

水解度=-6.456 15+0.867 48A+4.359 39B+0.237 72C+ 0.004 926 81AB-0.004 347 9AC+0.148 99BC-0.017 562A2-1.550 66B2-0.005 880 44C2，R2=0.978 1.

多肽含量=-4.155 73+0.071 886A+0.938 93B+0.152 36C +0.006 761AB -0.001 375AC-0.005 998 7BC-0.001 302A2-0.124 28B2-0.001 418 5C2，R2=0.9915.

方差分析结果(见表4)表明，以水解度为指标，模型P值小于0.000 1，表明该模型高度显著，而模型的失拟性P值为0.4178>0.05，而以多肽含量为指标，模型P值小于0.000 1，表明该模型高度显著，而模型的失拟性P值为0.1163>0.05，说明模型与实际情况拟合情况良好，可以使用该模型对实际试验进行预测和分析.影响酶解液中水解度的因素顺序为：温度C>时间B>酶浓度A；酶浓度、时间、温度对酶解液中多肽浓度的都较大，其中A、C的交互作用最为明显.

表2　响应面因素水平表

表3　响应面分析方案及试验结果

表4　方差分析1)

1) 当P<0.01时高度显著，标记为**，当0.010.05时不显著，标记为-

由图6可看出酶浓度、酶解时间、酶解温度三者之间的交互关系.其中时间与酶浓度、酶浓度与温度之间的交互关系不是特别显著，表现为曲面较平缓，时间与温度的交互关系比较显著，表现为曲面较陡.当酶浓度小于16.87U/g，水解度随着酶浓度的升高而增大，随着酶浓度继续增加，水解度几乎不发生变化.当温度固定时，时间对水解度的影响比较显著，呈先升后降的趋势，当温度固定在41.9 ℃时，3.3h时水解度达到最大值.

图6　各因素对酶解罗非鱼下脚料水解度的影响

Fig.6InfluenceofdifferentfactorsonthedegreeofhydrolysisofTilapiawaste

图7可看出酶浓度、温度、时间三者之间的交互关系.其中时间与酶浓度、酶浓度与温度、时间与温度的交互关系都比较显著，表现为曲面较陡，其中酶浓度与温度的交互关系最为显著，这与表4中各因素交互的P值相对应(PAB=0.001 3，PAC<0.000 1，PBC=0.002 6).在AB的交互作用中，多肽浓度随着酶浓度的升高而增大，随着酶浓度继续增加，多肽浓度几乎不发生变化.在AC的交互作用中，当酶浓度固定时，温度对水解度的影响比较显著，呈先升后降的趋势.在BC的交互作用中，酶浓度固定时，在一定的温度范围内，温度和时间的变化对多肽浓度的影响不是特别显著.

3　结论

由回归方程预测因素水平内的最佳酶解工艺为：酶浓度16.87U/g(即0.553mg/g)，料液比1∶5、自然pH、温度41.94 ℃、酶解3.31h.在此酶解条件下进行验证实验，水解度为18.09%，多肽含量为0.9mg/mL，证明此模型是可靠有效的.

图7　各因素对酶解罗非鱼下脚料多肽含量的影响

Fig.7InfluenceofdifferentfactorsonthepeptidecontentofTilapiawaste

采用弹性蛋白酶对罗非鱼加工下脚料进行酶解，可以制备富含多肽的酶解液.研究结果对罗非鱼加工下脚料的开发利用有一定的参考价值.

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Optimization of Enzymolysis of Tilapia Waste with Response Surface Methodology by Elastase

Qu Ye-hui1, Ding Li-jun1, Peng Wen-yuan1, Liu Shan-shan1, Huang Jin2, Cheng Xiao-ling1

(1.School of Chemical Engineering and Light Industry; 2. School of Materials and Energy,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Thehead,bones,andotherrawwasteofTilapiaarehydrolyzedbyelastase,andresponsesurfaceanalysismethodisusedtooptimizetheenzymaticprocesses.Theenzymeconcentration,temperature,pH,solidtoliquidratio,timeandotherfactorsarediscussedtoanalyzetheeffectofhydrolysisbasedonthedegreeofhydrolysisandpeptidecontent.Theresultsshowthattheoptimumconditionsofelastasehydrolysis:enzymeconcentration0.553mg/g,temperature41.94 ℃,time3.31h,pHnatural,solid-liquidratio1∶5,thedegreeofhydrolysisandthepeptidecontentisseparately18.09%and0.90mg/mlinthiscondition.

Tilapiawaste;responsesurfacemethodology;elastase；hydrolysis;peptide

2015- 10- 20

广东省教育部产学研合作重大专项(2013A090100009).

瞿叶辉(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为食品加工.

丁利君(1965-)，女，教授，主要研究方向为农产品加工与天然产物化学.E-mail:ddddlj@foxmail.com

10.3969/j.issn.1007- 7162.2016.05.014

TS254.9

A

1007-7162(2016)05- 0077- 06