微流控芯片非接触电导检测的研究进展

肖 羽， 史秋佳， 曾文珊, 陈缵光*

(1.广州市药品检验所，广东广州 510160;2.中山大学药学院，广东广州 510006)

1 引言

微型化和集成化是现代分析仪器发展的重要方向之一[1]。微流控芯片具有体积小、样品和试剂消耗少、分析速度快、样品处理简单、分离效能高等特点。它高度集成化，其分析过程包括进样、反应、过滤、分离、检测，可以在一块几平方厘米的芯片上得以实现[2]。目前用于微流控芯片的检测方法主要有：紫外-可见吸收检测、诱导荧光检测、质谱、化学发光检测、折射指数检测、电化学检测等。因为芯片内分离微通道的尺寸一般只有几十μm，检测光程很短，紫外检测的灵敏度很低；激光诱导荧光和化学发光检测的灵敏度高，但由于只能检测具有荧光或化学发光物质，应用范围有很大的限制；质谱法灵敏度高，能够提供结构和质量信息，可检测的分子种类多，但芯片与质谱仪的接口问题很难解决；电化学检测可检测的物质种类多，且检测限低，线性范围宽，选择性好，易于集成化、微型化，检测电路结构简单、成本低，直接将待测物的化学信号转化为电信号，避免了信号变换过程，减少了信号噪声。采用微细加工技术制作微电极或超微电极可提高电化学检测的灵敏度，符合微流控分析系统的要求[3]。

图1 微流控芯片的结构示意图Fig.1 Schematics of microfludic chip

常用的微流控芯片的结构如图1所示。在微流控芯片上加工有进样通道和分离通道[4]，在进样高压作用下，待测溶液随电渗流(EOF)从进样缓冲池经进样通道流入进样废液池。待测溶液完全填充进样通道后，关闭进样高压，施加分离高压，在分离高压作用下，进样通道与分离通道交叉区域的待测溶液中各待测组分随分离通道的EOF以不同速度运动，形成不同的组分区带。粒子在电解质中的迁移速度为电泳和EOF两种速度的矢量和。正离子的运动方向和EOF一致，最先流出；负离子的运动方向和EOF方向相反，最后流出；中性粒子的电泳速度相当于电渗流速度，在两性粒子之间流出，各种粒子在不同时刻经过位于分离通道末端的检测器，利用信号检测电路检测，即可得到待测溶液各组分的分离谱图[5]。

非接触电导是直接将检测电极放置在分离沟道的芯片外表面，避免电极与待测溶液的直接接触，有效消除高压分离电场对检测的干扰及电极污染问题，实现检测电极与被测溶液之间的耦合，通过测定分析物的电导变化实现检测[6]。

2 微流控芯片非接触电导检测技术的研究进展

非接触电导检测技术早期主要用于无机离子的检测，后来又逐渐扩展到有机酸、脂肪醇、有机胺、氨基酸、糖、肽及蛋白质，有机磷化合物等的检测。最初的应用可追溯到20世纪60年代，主要应用于工业工程传感检测、高频电导滴定[7]等方面。当时所用的非接触电导检测器采用4根金属丝电极呈放射状垂直固定在聚四氟乙烯毛细管的外壁上，其中两个电极与高频信号源连接作为激发电极，另外两个电极作为接收电极。2000年Weber等[8]首次将非接触电导检测集成在微流控芯片上，采用溅射-光刻工艺在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基片上制作检测电极，使用一层PMMA薄膜隔离电极与沟道中的溶液，该电极与溶液之间通过绝缘膜耦合，检测池结构简单，电极易固定，易微型化、集成化。2001年Guijt等[9]采用四电极非接触电导检测器耦合于玻璃芯片，使用碳化硅层作为绝缘层覆盖电极，该检测器稳定性更好，相应更灵敏，线性范围更宽。2002年Pumera等[10]把两个铝膜电极集成于一层厚度为125μm的PMMA薄膜上，这一种微电泳芯片非接触电导检测系统的集成相对简便，成本更低。2004年Guijt等[11]采用PMMA材料为基片，把电导检测电极加工在玻璃盖片上，组成一个新的电泳芯片非接触电导检测系统。2006年陈缵光等[12]将进样和分离通道蚀刻在玻璃基片的表面，采用一层薄玻璃覆盖在电极表面作为电导检测器的绝缘层，成功将电容耦合非接触电导检测器集成到微流控芯片单通道上，可在较低的激发频率和较低的激发电下工作，安全和稳定性更好。

3 微流控芯片非接触电导检测技术的应用

3.1 无机离子的检测

无机离子的检测是根据样品区带电导和测量背景电解质之间差异来进行的，因此选用低电导率、离子强度大的背景电解质。阳离子的迁移方向与电渗方向相同，阴离子的迁移方向与电渗方向相反，导致阴离子出峰时间晚或不出峰，需要在缓冲溶液中加入电渗改性剂改变EOF方向。常用的是阳离子表面活性剂，如十二烷基、十四烷基、十六烷基三甲基溴化铵等，或加入不同体系的有机溶剂，如甲醇、乙腈、阳离子表面活性剂等。Wang等[13]对普通阴离子包括氯离子、硫酸盐、氟化物、乙酸盐和磷酸盐阴离子进行检测，其中氯离子的检出限为6.4 μmol/L。Kuban[14]及Lee等[15]使用外置电极电泳芯片检测了饮料和饮用水中的无机阳离子和阴离子。

3.2 有机离子的检测

有机物大部分以弱电解的离子状态存在，所带电荷与体积之比较低，检测灵敏度不是很理想。Chen等[16]分离检测了标样中的多巴胺、儿茶酚和有机阴离子、有机酸；Kuban等[17]定量分析了饮料中的有机阴离子。Law等[18]采用组氨酸-酒石酸盐(pH=6.5)缓冲液检测了饮料中的常规防腐剂及维生素C。Tanyanyiwa等[19]成功分离三种β-受体阻滞剂和五种胺，检出限为0.06～5 μmol/L。 Wang等检测了河水样品中三种可用于军事目的的神经毒剂(Srrin、Soman、VX)及其降解物[20]；又基于有机磷神经毒剂与磷酸水解酶的反应，测定了多种有机磷毒剂[21]。Gong手性分离反式环乙烷-1，2-二胺对映体[22]，检测人尿样和血清样本中的γ-羟丁酸(GHB)浓度，临床样品中的检出限为2 μg/mL[23]。Zhang等[24]使用聚阳离子涂层的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，使EOF反向，在负分离电场下快速分离检测了尿样中尿酸及杭坏血酸(AA)。Lu等[25]采用20 mmol/L的柠檬酸-组氨酸(His)为缓冲溶液快速检测果汁和自来水中的氟乙酸钠，检出限为1～2 mg/L，总分析时间少于5 min。Kumar等[26]采用2-(N-吗啉代)乙磺酸-组氨酸(MES-His)缓冲溶液快速测定土壤与水样中的肼类化合物，肼、甲基肼和1-1-二甲肼的检出限分别为6.5、15.3和11.4 ng/mL。

3.3 氨基酸、肽类的检测

氨基酸是生物大分子的基本组成结构单元，在采用荧光、此外等光学检测时，需要将其转变为对应的衍生物才能检测，但因为氨基酸、蛋白质在强酸性缓冲溶液中带正电荷，不需要进行衍生就可以用微流控芯片非接触电导检测器进行检测，而且分析过程中所需分析物的量极少，这对于不易取得的分析物而言是一种很好的应用技术。氨基酸分子中既有碱性的氨基又有酸性的羧基，为两性电解质，其中羧基和氨基的解离度取决于缓冲溶液的pH值，肽由两个或两个以上氨基酸键合而成。Aiping等[27]利用微流控芯片非接触电导检测器检测人血液中的尿素。童艳丽等[28]采用配体交换技术，以Cu2+和L型氨基酸络合物作为手性选择剂成功分离蛋氨酸、苯丙氨酸、青霉胺3种手性物质，检出限达到5 μmol/L。肖羽等[29]采用MES-His缓冲溶液成功分离注射液中门冬氨酸、鸟氨酸两种氨基酸。

3.4 药物分析

目前的药物分析中，微流控芯片非接触电导检测法主要应用于药物成分分析和手性拆分领域，其中对药品主成分进行含量测定的报道占大多数。在药物的分离检测中其具有样品预处理简单、分析速度快、操作方便、成本低等优势。近年来，微流控芯片非接触电导检测法在天然药物、合成药物及药物制剂的分析检测上的应用越来越广泛,杨秀娟等[30]采用Tris-H3BO3(pH=8.0)缓冲体系分离检测日夜百服咛片中盐酸伪麻黄碱和氢溴酸右美沙芬，检出限分别为10、5.0 mg/L。吴小林等[31]采用Tris-H3BO3(pH=7.5)缓冲体系快速分离丹参滴注液中丹参素和原儿茶醛，检出限分别为5.0、10 mg/L；测定滴鼻液中盐酸萘甲唑啉，检出限为5.0 μg/mL[32]。2010年姜清芳等[33]采用Tris-H3BO3(pH=7.5)缓冲体系分离检测盐酸普蔡洛尔和酒石酸美托洛尔，检出限分别为10、20 mg/L。王充等[34]采用HAc-NaAc(pH=4.5)缓冲体系测定注射液中苦参碱，检出限为1.0 μg/mL。李永冲等[35]采用HAc-NaAc(pH=4.5)缓冲体系测定丁溴东莨菪碱注射液中丁溴东莨菪碱，检出限为6.0 μg/mL。周勰等[36]采用MES-His缓冲体系测定盐酸异丙嗪，检出限为10 mg/L。2011年蔡自由等[37]采用HAc-NaAc(pH=4.5)缓冲体系成功实现了几种药物的的快速检测，其中盐酸金刚烷胺检出限为0.6 mg/L，盐酸吗啉胍检出限为2.0 μg/mL[38]，盐酸利多卡因检出限为5.0 mg/L[39]，盐酸奈福泮检出限为1.2 μg/mL[40]，溴吡斯的明检出限为0.6 μg/mL[41]。李永冲等采用HAc-NaAc(pH=4.5)缓冲体系快速测定盐酸雷尼替丁胶囊中盐酸雷尼替丁含量，检出限为1.3 μg/mL[42]；盐酸小檗碱片中盐酸小檗碱，检出限为2.0 μg/mL[43]；普鲁卡因注射液中盐酸普鲁卡因，检出限为5.0 μg/mL[44]；盐酸金刚烷胺片中的盐酸金刚烷胺，检出限为0.6 mg/L[45]；盐酸地芬尼多片中盐酸地芬尼多，检出限为2.0 μg/mL[46]；盐酸倍他司汀片中盐酸倍他司汀，检出限为1.0 μg/mL[47]。2012年翟海云等[48]采用5.0 mmol/L HAc快速测定加替沙星注射液中加替沙星的含量，检出限为1.0 μg /mL。2013年杨辉等[49]采用硼酸缓冲液(pH=9.6)快速测定葡萄糖氯化钠注射液中Na+和葡萄糖，检出限分别为8.2、26.7 μmol/L。

4 微流控芯片非接触电导检测的影响因素

4.1 缓冲溶液的影响

在不同的测定中，所使用的缓冲溶液的种类、浓度不同，各离子对EOF速度的影响不同。非接触电导检测是基于样品和缓冲溶液的电导差进行检测，电导差越大，灵敏度越高。缓冲溶液的浓度决定Zeta电位和双电层厚度的大小[50]，随着缓冲溶液浓度的增加，信噪比降低，形成离子对的几率增大，使双电层变薄，电渗流速度减小，各离子迁移时间变大，分析物的保留时间增大，分离效果变好[51]，同时背景压力值增大，与检测离子之间的电导差减小，使检测灵敏度下降，溶液电导变大，分离电流增加，焦耳热增加，基线噪音增加。因此，可以通过调节缓冲溶液的浓度来调节分析物的分离速度。陈蓉等[52]对PMMA微流控芯片中的EOF速度进行考察，研究发现NH4Ac浓度溶液在10～50 mmol/L范围内，PMMA微流控芯片中的EOF速度与其溶液浓度成反比。不同缓冲溶液种类体系下，EOF与缓冲溶液之间所存在的定量关系式不同，但EOF值都是随缓冲溶液浓度增加而减小。李红旗等[53]研究发现无论在弱电解质溶液中还是在强电解质溶液中，EOF的速度与溶液的pH值均呈线性关系。Schwer等[54]和Lambert等[55]研究发现，在pH<3或pH>8时，EOF随着pH值变化平缓，当pH值在5～6之间时，EOF速度变化很快，总体来说EOF速度随着pH值的增加而增大。

4.2 添加剂的影响

在缓冲溶液体系中，所使用的添加剂种类较多，如无机电解质、两性电解质、表面活性剂、有机溶剂等等。添加剂一方面可以通过动态涂布改变管壁的电荷性质，双电层中的粘合度等；另一方面可以改善分析物与缓冲液的结合度，直接改变溶液的粘度。其中增粘剂主要是纤维素及其衍生物，非增粘剂包括有机阳离子，两性离子，中性分子。无机电解质可以使双电层变薄，EOF减小，但高浓度的无机电解质容易导致过热，使分离效率下降；两性电解质可以使通道壁的负电荷增加，从而增大EOF而不产生较大电流；有机溶剂可以增加溶液的粘度，使EOF速度减小，但不能改变EOF方向；表面活性剂可以改变溶剂的Zeta电位、粘度，通过疏水-离子相互作用的可逆和不可逆吸附到通道内壁，影响壁上的电荷数量及其分布，影响EOF的大小[56]。微流控芯片非接触电导检测常用的是阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，当CTAB的浓度达到一定量时，可以使EOF反转向阳极移动。

4.3 分离电压的影响

高电压下，毛细管电泳微流控芯片焦耳热不能有效扩散，引起温度升高，从而使溶液粘度减小，进而使EOF增大。升高分离电压，出峰时间明显缩短，有利于加快分析速度，但分离电压过高，电流增大，焦耳热亦增大，会导致噪音大幅度增加，分离度变差，不利于分离。

4.4 进样时间的影响

在电场强度一定的情况下，进样时间直接影响进样量，进样量的多少对于检测灵敏度直接相关，随着进样时间的增大，信噪比增加，单分离效率和分离度变差，进样量过大时，各离子不能有效地分开，且会导致区带展宽，峰拖尾现象。通过缩短进样时间可提高各离子的分离度，但也会造成进样量太小，响应信号过低，检测困难。

4.5 温度的影响

一般来说在一定的范围内，电导率和温度存在线性关系，温度升高时，对于强电解质溶液，离子的水化作用减弱，溶液的粘度降低，从而使离子的运动速度增大，引起电导的增加；对于弱电解质，会直接影响电介质的电离常数，使电离常数增大。温度升高亦会使离子热运动加快，导电能力增加，由此可能会造成样品迁移时间、峰面积的偏差和分离效率的下降。温度还会影响微分流通道内壁的双电层厚度。因此在检测时必须消除或尽量减少温度对电导率的测定的影响，最好要保持温度恒定。

5 微流控芯片非接触电导检测技术存在的问题和展望

微流控芯片非接触电导检测器输出信号十分微弱，属于微弱信号检测范畴，且检测器输出信号易受各种噪声干扰，如芯片材料性质、片基材料不均匀或污染造成的芯片噪声、检测电路本身的电气噪声、分离电场对检测效果的干扰噪声等。因此，采用有效地检测方法从各种噪声中检测出真实信号至关重要。微流控芯片的发展依赖于微细加工技术的进步，目前许多方面还没得到很好的解决，如芯片材料的选取、微通道的网络结构和沟道尺寸的优化设计、功能单元的集成、扩大芯片的通量、芯片的集成化和标准化程度等。目前微流控技术在医药方面的应用尚处早期阶段，大多是针对简单的化学药品或单一中药制剂进行的研究，随着该技术受到越来越多的关注，其应用范围将得到进一步的扩大。