核酸工具酶辅助的信号放大技术在生物分子检测中的应用

苏 晨， 吉邢虎， 何治柯

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

1 引言

基因工程技术作为现代生物科学技术的核心而受到极大关注，被广泛应用于工业[1]、环境[2]、能源[3]、医药卫生[4]以及农牧业[5]等领域。基因工程的关键技术是脱氧核糖核酸(DNA)的连接和重组，在此过程中一些酶起着至关重要的作用，这些酶统称为基因工程工具酶。工具酶种类繁多、功能各异，主要包括限制酶、聚合酶、连接酶、修饰酶和核酸酶等。这些酶具有特异性的序列识别能力以及高效的生物催化活性，在一定的条件下可以对核酸分子进行切割、连接、扩增以及修饰等，同时工具酶的反应条件温和且具有出色的生物相容性[6]。基于这些优势，工具酶被广泛地应用于核酸[7,8]、蛋白质[9,10]和小分子[11,12]等生物活性分子的分析检测。

生物分子比较复杂，待测物的含量很低，常规的检测手段往往受到限制，因此，提高检测的信号强度，构建基于信号放大技术的超灵敏检测方法成为目前生化分析领域中越来越重要的研究方向。本文主要介绍几种工具酶参与的信号放大技术及其在核酸、蛋白和小分子等生物活性分子检测中的应用。

2 工具酶在核酸检测中的应用

核酸也称多聚核苷酸，它是由许多个核苷酸聚合而成的能够自我复制的生物大分子。核酸作为遗传物质的基础，在各种重大的生命活动，如生长、发育、遗传及变异中起到了至关重要的作用。近年来，为了提高核酸检测的灵敏度，构建出大量新型工具酶参与的信号放大技术。高灵敏、特异性的核酸检测方法不断涌现，在传染病诊断[13]、microRNA分析[14]、遗传学研究[15]、法医鉴定[16]和生物医学研究[17]等领域中得到了飞速发展。

2.1 基于聚合酶的核酸检测

传统的聚合酶参与的信号放大技术，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)[18,19]，操作过程复杂，需依赖耐高温的聚合酶和特殊温度循环反应器才能实现。相比热循环放大技术，DNA在恒定温度下聚合的等温聚合放大反应操作简便，不需要任何复杂设备，受到越来越多核酸研究者的青睐。目前，常用的等温聚合放大技术有：滚环扩增(Rolling-circle Amplification，RCA)[20]、聚合酶触发的链置换扩增(Strand-displacement Amplification，SDA)[21]、解旋酶依赖扩增(Helicase-dependent Amplification，HDA)[22]和环介导的等温扩增(Loop-mediated Isothermalamplification,LAMP)[23]等技术。

2.1.1滚环扩增技术RCA是一种基于特殊DNA聚合酶的等温信号放大技术。这类特殊的聚合酶包含有phi29聚合酶、BstDNA聚合酶和Vent exo-DNA聚合酶，它们具有多重置换和连续合成的特性[24]。在该类酶的作用下底物核酸生长链以一段闭合环状的DNA链作为模板，不断复制延伸，扩增出很长的单链核苷酸(ssDNA)。该产物核酸链中含有的数百个重复序列可以进一步作为信号载体，结合不同的检测手段而实现信号放大的作用。滚环扩增产物最常用的检测手段就是荧光检测。滚环扩增产物的荧光信号通常来自于荧光染料标记的dNTP(图1A)和荧光团标记的互补链(图1B)。为了降低体系的背景荧光，分子信标(图1C)和DNA嵌入试剂(图1D)也被广泛地应用于滚环扩增产物的荧光传感中。

除了荧光信号，一些可用肉眼观察的比色信号也被引入到滚环扩增的信号放大方法中。Yao等[25]研究发现，磁性纳米颗粒可以与较长的线性DNA链(如滚环扩增产物)物理结合，并形成相互缠绕的肉眼可见的聚合体。模板探针与靶核酸链的部分区域互补配对后，在连接酶和phi29聚合酶的作用下连接成一个环形的模板链，并发生滚环扩增反应。反应结束后加入的磁性微球在稳定磁场的诱导下发生聚集。在没有滚环产物存在时，形成的聚集体在轻轻吹打下容易分散成悬浮液，而滚环产物与磁性纳米颗粒形成的复合物能维持聚集体的形态，可在滤纸上产生肉眼可见信号，从而实现靶核酸链的可视化检测。Wang等[26]利用金属依赖催化活性脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)的探针切割反应作为滚环扩增产物的检测信号，结合树枝状叠加的滚环反应，构建了一个超灵敏的核酸检测方法。

2.1.2链置换扩增SDA是一类拥有链置换活性，且没有外切酶活性的核酸聚合酶，以母链为模板延伸引物链，同时将下游旧链剥离，聚合酶与引物的反复延伸和替换，反应不断循环进行，产生大量的DNA重复单元。通过引入荧光染料、双标记探针、电化学材料等信号载体，可实现靶核酸的高灵敏检测。Guo等[27]使用双标记的荧光分子信标作为信号载体，构建了一个过程简单、通用性强的Klenow fragment exo-聚合酶触发的链置换反应核酸检测方法，实现了靶核酸链高灵敏的荧光检测，检测限低至6.4 fmol/L。Fu等[28]设计了一个分子信标结构的DNAzyme，与模板链结合以后分子信标被打开，发卡结构被破坏，无法催化H2O2和ABTS发生显色反应。如图2所示，靶核酸链加入后，与模板链互补杂交并通过竞争作用使分子信标分离，恢复原来的结构，从而恢复DNAzyme的催化能力，产生比色信号。在序列特定的引物和聚合酶存在时，聚合扩增反应发生，置换出靶核酸链进入下一轮循环，使更多DNAzyme信标从模板链上分离，恢复活性，实现检测信号的放大。同样，可将辣根过氧化物酶作为化学发光信号载体引入链置换放大技术。He等[29]提出了一个基于聚合酶触发的链置换放大技术和功能化磁珠的多目标同时检测核酸的传感器，利用引物修饰的磁珠和生物素标记的DNA发卡形探针，在不改变灵敏度的情况下进一步增强了该方法的通用性，有利于实现两种靶核酸链的同时检测。

2.1.3环介导的等温扩增Notomi等[30]首次提出的LAMP是一种快速、高特异性、超灵敏的核酸指数放大技术，该技术利用四条特异的引物链与靶核酸链的六个区域互补杂交，在具有很强链置换活性的聚合酶的作用下，实现等温条件下核酸链扩增。DNA双链在温度65 ℃附近处于复性和延长的动力学平衡状态。不同于传统的PCR技术，该放大技术对引物链的特异性有很高的要求，需要两对引物链，分别是两条内部引物链(FIP及BIP)和两条外部引物链(F3及B3)(图3)。在扩增过程中，内部引物扩增形成反应物模板，外部引物通过扩增置换分离内部引物扩增链。LAMP分为底物起始模板合成阶段，循环复制反应阶段，以及延长重新循环阶段。内部引物(FIP)以靶核酸链为模板扩增出与其部分互补片段，同时，外部引物(F3)与靶核酸链结合触发置换聚合反应，使内部引物扩增链从靶核酸链上脱离，由于FIP5′端保留有部分序列(F1c)与扩增出的核酸片段中的部分序列(F1)反向互补，这条内部引物扩增链于5′端自我碱基配对形成茎环结构。当此扩增链与另外两条引物(BIP和B3)退火杂交后，触发聚合置换反应，在内引物BIP扩增片段的一端也形成了一个茎环结构，构成哑铃状的结构，即环介导的等温扩增反应物起始模板。如此循环往复，周而复始，在1 h内就能扩增出109靶核酸复制片段，最后的产物是大量结构类似花菜的核酸链。这些核酸链由若干具有反向交替重复序列的茎环结构构成。

除了使用荧光标记探针、嵌入染料等荧光信号载体，Goto等[31]将指示剂羟基萘酚蓝(Hydroxy Naphthol Blue,HNB)应用于环介导放大产物的比色检测[31]。当靶核酸链存在时，启动环介导扩增反应，溶液的颜色由紫色逐渐变成天蓝色，通过引入96孔板作为扩增反应的载体，使基于HNB显色的环介导扩增反应能够应用于多种核酸的同时检测。为了进一步实现环介导扩增参与的高通量核酸检测，Luo等[32]利用集成电极微流控芯片作为检测平台，实现了结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)、流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza，HIN)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumonia，KPN)三种核酸链的同时检测，检出限可以低至28、17和16拷贝/微升。

2.2 基于核酸酶的核酸检测

核酸酶是一类对底物核酸具有切刻或者连续消化能力的蛋白酶，自20世纪60年代以来，它常作为一种模型蛋白被广泛应用于分子生物学的研究中。核酸酶的作用方式和底物特异性都随着来源的不同而存在差异，根据核酸酶作用位置的不同，将其分为限制性内切酶和核酸外切酶两种。

大多数限制性内切酶可以识别含有回文序列的双链DNA，并对其两条核酸链均进行切割。同时，限制性核酸内切酶中还有一类特殊的酶称为切刻内切酶(Nicking Endonuclease，NEase)，这类酶只能在特定的酶切位点上对双链DNA中的一条链进行酶切水解作用，最终造成一个切口而不是切断。利用切刻内切酶的这个特殊性质来切割信号探针并反复循环使用靶核酸链，可以实现检测信号的循环放大，已被广泛地应用于构建核酸或其它相关靶分子的生物传感器。Zou等[33]提出了一个串联使用分叉DNA单链内切酶(Flap Endonuclease)和NEase的核酸信号放大检测方法(Cascade Enzymatic Signal Amplification,CESA)。传感器设计原理如图4所示，两条探针链up和dp可以与靶核酸链T1杂交，由于探针dp设计的熔链温度Tm与酶反应的温度一致，当两条探针与T1链的杂交序列发生重叠时，dp链的5′端的分叉链会被分叉DNA单链内切酶割下，切割后的dp探针从T1链上脱离下来。up和T1的杂交链进入第一步循环，获得大量的dp链。被切割下来的分叉链与5′端磷酸化的链通过连接酶连接后，形成一个酶切位点，打开分子信标，并在切刻内切酶的作用下对其进行切割分离，启动新一轮的循环放大反应，实现检出限为1 fmol/L的核酸超灵敏检测。

核酸外切酶可以沿着核酸链末端依次水解作为核酸骨架的磷酸二酯键并生成单核苷酸。依据作用底物单双链的区别，可将核酸外切酶分成两类，对单链具有特异性水解能力的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ(exoⅠ)和核酸外切酶Ⅶ(exo Ⅶ)，以及能特异性水解双链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(exo Ⅲ)和λ-噬菌体核酸外切酶(λ-exo)等。这些酶中还可以根据酶切起点的不同，分为从分子链的3′末端或5′末端开始切断的酶。核酸外切酶Ⅲ作用双链DNA时，沿着3′→5′方向逐步催化去除单核苷酸，没有特异性的结合位点，但是对双链DNA的3′端突出末端和单链不发生水解作用。利用核酸外切酶Ⅲ特异性剪切水解互补3′端的这个特性，在目标物存在时，可将信号分子如染料分子与其猝灭剂分离，恢复荧光信号。进一步循环使用目标物，可放大核酸信号，提高检测灵敏度。随着荧光分析的快速发展，大量猝灭剂被应用到基于核酸外切酶Ⅲ的信号放大方法中，如猝灭基团[34]、氧化石墨烯[35,36]、单壁碳纳米管[37]、钯纳米线[38]等。除了使用猝灭回升的信号生成手段，Willner等[39]构建了核酸外切酶Ⅲ参与量子点-染料荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)信号放大方法。此外，比色信号[40]、化学发光信号[41]和电化学信号[42]等被引入核酸外切酶参与的信号放大检测方法，很大程度上拓展了核酸外切酶的应用范围。值得一提的是，Lu等人[43]将核酸外切酶Ⅲ辅助的靶核酸循环放大技术与流式细胞仪微球相结合，构建了一个快速、可再生的高通量多元核酸同时检测平台。相比传统的流式细胞仪微球方法，灵敏度提高了58.6%。

根据核酸酶底物不同，可分为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。核糖核酸酶(RNase)是一类具有水解RNA能力的核酸酶。例如RNase H是一种没有序列特异性的酶，可以识别DNA和RNA组成的异源双链核酸分子并特定地剪切RNA链[44]。利用这个特性，Goodrich等[45]构建了一个基于RNase H和RNA微阵列的超灵敏核酸检测平台。如图5所示，微阵列上的RNA序列可以特异性识别靶核酸DNA链并形成异源双链核酸分子，在RNase H的催化作用下，RNA被水解成小碎片，释放出的靶核酸链继续与另一条RNA结合并导致其降解，从而实现目标核酸链的循环放大。该平台直接使用表面等离子体共振成像技术，对10 fmol/L浓度的DNA单链进行定量。该方法不仅可对未纯化的PCR产物进行检测，还可利用微阵列表面DNA-RNA异源双链核酸分子的等温吸附线，对反应过程中RNase H的动力学进行研究。DNase I是一类能够非特异性水解单链或者双链DNA的酶，水解产物可能是单个脱氧核苷酸，也可能是以单链或双链结构存在的寡脱氧核苷酸链。更重要的是，DNase I对DNA-RNA异源双链核酸分子中的DNA单链有很强的水解能力，常常被应用于RNA的分析检测中。此外，氧化石墨烯对核酸链的非特异性吸附作用能保护核酸链不被DNase I降解，为基于DNase I的信号放大方法提供了条件[46]。

2.3 基于连接酶的核酸检测

DNA连接酶(DNA Ligase)也可称为DNA黏合酶，主要起着连接DNA链的3′羟基末端和另一条DNA链的5′磷酸根末端的作用。连接酶最终通过磷酸二酯键将两段相邻的DNA链连接起来，形成一条完整的DNA链，从而在分子生物学领域起着特殊而关键的作用。自从1991年连接酶链式反应(Ligasechain Reaction，LCR)[47]提出后，该方法展示出了出众的信号放大能力和选择性。相关生物传感器的设计通常是利用两条DNA探针和一条引物链杂交后，构成具有一个切口的双链结构，然后启动连接酶连接切口。Yin等[48]使用靶核酸链作为引物链，纳米金偶联的DNA作为探针链，开展核酸高灵敏检测方法研究(图6)。在靶核酸链辅助下，Ampligase DNA连接酶发生连接反应，将两个纳米金连接起来，加热变性后，靶核酸链游离出来，可以与另外两条未连接的探针杂交，启动新的连接酶反应。这个过程循环反复，靶核酸链模板被成倍放大，越来越多的纳米金通过核酸链的连接作用而聚集在一起，发生颜色变化。基于DNA连接酶和纳米金聚集的方法所产生的信号，不仅可以用紫外-可见吸收光谱法进行检测，还可以用动态光散射的方法来检测，其检出限极低，分别为1.5 amol/L和0.1 amol/L。

除纳米金作为探针和信号的载体[48,49]外，大量其他材料也可作为载体应用于信号放大检测技术。Chen等[50]将一条探针链与磁珠相连，另一条探针链修饰上生物素，通过连接酶的连接、磁珠的分离以及生物素-亲和素的特异性作用，将辣根过氧化物酶连接在磁珠上，产生比色信号，检出限为30 pmol/L。Zhu等[51]将两条探针链分别修饰在量子点和磁珠上，利用T4连接酶和电化学信号，构建了多目标microRNA同时检测的核酸传感器[51]。

3 工具酶在蛋白质及小分子检测中的应用

除了核酸，蛋白质(如凝血酶)和小分子(如腺苷)等其他活性分子，在生物的各项生命活动中也都起到了举足轻重的作用。这些生物分子的快速灵敏检测，对于了解其正常功能具有直接而现实的意义。

3.1 核酸适配子辅助的蛋白质及小分子检测

1990年，Tuerk和Gold利用SELEX技术成功筛选出了聚合酶的寡核苷酸，为其命名核酸适配体，从此开启了核酸适配体研究的新时代[52]。核酸适配体是一段能结合不同靶分子的DNA或者RNA序列，它们之间的这种结合能力具有高度特异性和亲合力。利用核酸适配体作为转换器，可以实现核酸检测与蛋白质及小分子检测之间轻松的转换，从而将核酸工具酶参与的信号放大方法灵活地应用到蛋白及小分子的检测当中。

与核酸检测类似，Yu等[53]将分子信标上修饰有荧光基团的茎延长，组成一段血小板源生长因子BB(PDGF-BB)的适配子序列。与靶蛋白PDGF-BB结合后，分子信标的二级结构发生改变，引物链结合上去，启动Klenow fragment exo-聚合酶的扩增反应。反应过程中，在形成一条完全互补的DNA双链的同时，改变了适配子的二级结构，靶蛋白脱离出来，进入靶分子循环置换聚合反应(Circular Common Target Molecule Displacement Polymerization，CCDP)，实现靶分子的放大检测。为了进一步降低体系的背景，获得更高的灵敏度，Hu等[54]引入氧化石墨烯作为猝灭剂，实现γ-干扰素的高灵敏检测，检出限低至1.5 fmol/L。除了通过与靶分子结合后探针二级结构改变，暴露出引物链的结合序列，触发酶的复制聚合反应，还可以利用核酸适配子与靶分子的高亲和性，竞争出游离的引物链，在模板链和phi29聚合酶的作用下，启动滚环扩增反应，实现靶分子的放大检测(图7A)。Chen等[20]利用这个策略，构建了一个基于适配子和滚环扩增技术的蛋白质检测方法，以凝血酶作模板，检出限为2 fmol/L。Huang等[55]利用类似的方法结合电极上修饰的捕获探针，将靶分子触发扩增出的滚环反应产物捕获，并作为电化学信号的载体，对赭曲霉素A的检出限低至0.065 ppt。Yuan等[56]用环介导的等温放大技术取代滚环扩增技术，构建了赭曲霉素A电化学检测方法。如图7B所示，以核酸适配体作为环介导的等温放大反应的引物，靶分子与核酸适配子结合后从纳米金修饰的电极上脱离，聚合扩增反应无法进行，用电信号变化的程度对靶分子进行定量，检出限为0.3 pmol/L。

切刻内切酶参与的蛋白质及小分子放大检测的方法，通常是设计一段包含有特定核酸适配子序列的发卡结构，当靶分子与适配子序列结合后，改变核酸发卡的二级结构，暴露出的序列作为模板链与引物链杂交，形成具有酶切位点的双链结构，在切刻内切酶的作用下，引物链被剪切形成一个切口。模板链与引物链分离，紧接着与另一条引物链结合，如此循环，产生大量带有切口的引物链。通过设计带有不同信号载体的引物链，构建出产生不同信号的蛋白及小分子传感器[57 - 59]。

3.2 无适配子辅助的蛋白质及小分子检测

除了核酸适配子的特异性结合作用，传统的抗原抗体反应也可与工具酶参与的信号放大技术结合，构建蛋白质的高灵敏检测方法。Wu等[60]首次将滚环扩增技术引入一个基于纸芯片的电化学发光体系，结合DNA功能化的碳点(Carbon Dots，CDs)，实现了蛋白的高灵敏度和选择性检测，如图8所示。首先，在纸芯片的纤维素表面通过种子生长法修饰一层纳米金薄膜，再通过夹心免疫的方式捕获靶蛋白分子—人免疫球蛋白(Human IgG，H-IgG)，当二抗上标记的纳米金与引物链偶联以后，在环状模板链和Phi29 DNA聚合酶存在下启动滚环扩增反应，复制并延长引物链形成一条很长的核酸单链，将大量DNA功能化的CDs通过互补杂交作用负载到滚环扩增产物上，产生电化学发光信号，检出限低至0.15 fmol/L。Liu等[61]利用端粒酶扩增技术参与的夹心免疫方法，将巯基丙酸修饰的电极作为反应的载体，生物素修饰的二抗和生物素修饰的引物链通过亲和素的作用连接在一起。端粒酶的扩增反应将引物复制延长，产生一条很长的具有大量TTAGGG重复序列的核酸单链，在K+和卟啉铁的辅助下，形成若干个具有高度催化活性的G四链体DNAzyme，产生电化学信号。

有些蛋白质和小分子因为具有特殊的生物学功能，可以利用这些特殊的能力结合工具酶参与的信号放大技术，构建高灵敏检测方法。最典型的就是对各种修饰酶的检测。多聚核酸激酶(Polynucleotide Kinase，PNK)[62]是一种具有5′端激酶和3′端磷酸酶活性的蛋白酶，可以催化核酸链末端从5′-OH/3′-PO4转换成5′-PO4/3′-OH。多聚核酸激酶在细胞活动中的5′端磷酸化过程中扮演了重要的角色，与多种神经疾病紧密相关。Zhang等[63]利用多聚核酸激酶具有的5′端磷酸化能力，结合滚环扩增技术，构建了一个多聚核酸激酶的检测方法。连接酶的催化作用除了需要5′端的磷酸基团和3′端的羟基作为反应底物外，还需要消耗ATP来供给能量。利用这个特点，Yang等[64]设计了两条发卡核酸探针，伸出的茎端相互之间互补配对，结合成一个具有两个切口的哑铃状结构，可以被核酸外切酶完全水解。只有在ATP存在的时候，T4连接酶将两个切口连接起来，形成一个闭合结构，阻碍核酸外切酶的水解作用。嵌入试剂插入哑铃结构的双链部分产生很强的荧光信号，实现对ATP的超灵敏检测，检出限为1.2 pmol/L。

4 工具酶组合的多重放大技术及应用

为了获得更高的检测灵敏度，将多种信号放大技术结合起来使用是一种有效途径。基于切刻内切酶与DNA聚合酶组合作用的等温循环链置换放大技术，是近年来被广泛使用的一种工具酶组合信号放大技术。该技术的基本原理是：通过碱基的互补配对杂交形成切刻内切酶的识别位点后，切刻内切酶在该位点对其中的一条核酸链进行切刻作用产生3′端为羟基的切口。聚合酶识别该切口的3′端，以未切割的序列为模板，沿着3′到5′的方向复制聚合置换被切割链的另一段序列，最后形成一条完整的双链结构。形成的双链DNA再次被切刻内切酶识别剪切，启动聚合酶反应。如此“切刻-聚合-置换”的不断循环，得到大量单链核酸结构，从而实现核酸链的扩增与信号放大的目的。由于操作简单、扩增效果显著，切刻内切酶与DNA聚合酶组合使用的多重放大技术受到很多生化分析科研工作者的青睐。利用该放大技术，Willner等[65]设计了一种基于切刻内切酶和DNA聚合酶组合的DNA机器，并将其用于核酸的放大检测。如图9所示，目标核酸链作为DNA机器的“运转轨道”，与引物结合后，作为模板链启动DNA聚合反应，形成完整的双链DNA。复制扩增出的核酸链被切刻内切酶剪切形成切口，在聚合酶的作用下从“运转轨道”上置换下来，结合有引物链的目标核酸链，进入“聚合-置换-切刻”的循环过程，利用DNA机器的运转，产生大量核酸单链，最终导致纳米金的聚集产生比色信号，检出限为0.1 pmol/L。

为进一步提高生物分子检测的灵敏度，Zhang等[66]提出了基于多重聚合延伸循环酶切的指数级信号放大技术。当目标核酸链作为引物链与模板链结合后，启动聚合酶反应，聚合延伸产生切割位点。聚合产物链在切刻内切酶作用下形成切口，切口的3′端继续进行延伸置换反应，形成一重聚合延伸循环酶切反应。置换下来的核酸链作为引物链与另一条模板链结合，触发另一重聚合延伸循环酶切反应。两层循环反应的叠加，大大提高了目标核酸链检测的灵敏度，实现了目标核酸链的指数级信号放大。最后置换出的信号链以DNAzyme四链体的形式产生比色信号，检出限为2.5 pmol/L。利用类似的原理，Wang等[67]将基于多层聚合延伸循环酶切的指数级信号放大技术应用到microRNA的检测中，检出限为0.1 amol/L。除了切刻内切酶，其它剪切酶，如λ核酸外切酶(λ-exo)，也被引入聚合延伸循环酶切反应中。λ核酸外切酶能特异性地水解双链DNA磷酸化的5′端，而对单链DNA和未磷酸化的双链DNA没有作用。利用λ核酸外切酶的这个特性，Zhou等[68]设计了一个5′端磷酸化的DNA发卡形探针。以γ-干扰素为靶蛋白模型，与探针链上的核酸适配子区域特异性结合，打开发卡，在引物链和聚合酶的作用下启动DNA聚合反应。γ-干扰素被聚合延伸的引物链置换下来，进入聚合置换靶分子循环系统。聚合产生的DNA双链的磷酸化5′端触发λ核酸外切酶的水解反应。酶水解作用剩下的两段序列，一段进入杂交剪切链循环系统，另一段作为信号载体，以DNAzyme四链体的形式产生比色信号。在双重循环放大系统的辅助下，实现γ-干扰素的可视化检测，检出限为50 pmol/L。

5 结论与展望

核酸工具酶具有催化能力高、序列识别能力强、反应条件温和以及生物相容性好等优势，因而被广泛地应用于核酸、蛋白质和小分子等生物活性分子的分析检测。由于检测条件与待测物含量的限制，核酸工具酶参与的信号放大技术在生物分子的分析检测中受到了广泛关注。通过结合荧光、化学发光、比色和电化学分析等检测手段，核酸工具酶参与的信号放大技术为生命科学的研究不断提供新的思路和方法，逐渐成为生化分析领域中的研究热点。可以预见，核酸工具酶参与的信号放大技术必将在解决生化检测中的实际问题方面发挥越来越重要的作用。