同步荧光光谱法直接测定尿液中卡那霉素

毛永强， 胡美娜， 李 娜*， 张 丹

(1.辽宁工程技术大学理学院,辽宁阜新 123000;2.辽宁工程技术大学安全科学与工程学院,矿山热动力灾害与防治教育部重点实验室,辽宁阜新 123000)

卡那霉素(Kanamycin，KANA)是一种氨基糖苷类抗生素，对革兰阴性菌及耐药性金黄色葡萄菌具有良好的抗菌活性，临床上主要用于治疗敏感菌所致的肺部感染、尿路感染、胆道感染及腹腔感染等。但过量使用卡那霉素，易对人体健康造成严重危害，因此必须严格监控其使用[1]。目前卡那霉素的测定方法主要有紫外分光光度法、液相色谱法、酶联免疫吸附法等[2 - 4]。其中，紫外分光光度法操作简便但灵敏度较低，液相色谱法灵敏度较高但前处理程序复杂且仪器昂贵，酶联免疫吸附法简便易行但存在交叉反应等，因此建立一种简便、直接和灵敏的卡那霉素含量测定方法，对于指导合理安全用药具有重要的临床意义。

与传统有机染料相比，量子点(Quantum Dots，QDs)具有激发光谱宽、发射光谱窄而对称、尺寸可调和光化学性质稳定等优点。近年来以量子点为荧光探针建立的荧光光谱法，已广泛用于离子、生物大分子和生化药物等分析检测中[5 - 7]。因尿液中复杂基质的荧光干扰，常规荧光光谱法难以实现尿液中卡那霉素含量的直接测定。而同步荧光光谱法不仅能够有效避免复杂基质的荧光干扰，也具有简化谱图、提高选择性和减少光散射干扰等特点，已经得到广泛应用[8,9]。

本文采用同步荧光光谱法，通过选择合适的波长差，有效避免尿液中复杂基质的荧光干扰。基于卡那霉素对CdTe量子点荧光的增强效应，建立一种同步荧光光谱法直接测定尿样中卡那霉素含量的新方法。该方法操作简便、稳定性好及灵敏度高，直接用于尿液样品中卡那霉素含量的快速测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4500荧光分光光度计(日本，日立公司)；U-3310紫外-可见分光光度计(日本，日立公司)；pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；90-3恒温双向磁力搅拌器(上海振荣科学仪器有限公司)；3-30K高速台式冷冻离心机(德国西格玛有限公司)。

1.0 mg/mL卡那霉素标准溶液：准确称取50 mg卡那霉素(KANA，中国药品生物制品检定所)，蒸馏水溶解后转移至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，用时稀释至所需浓度；0.1 mol/L磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液；碲粉、硼氢化钠、氯化镉、巯基乙酸和氢氧化钠。以上所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 CdTe量子点的制备

参考文献方法[10]制备巯基乙酸修饰的CdTe量子点。准确称取160 mg硼氢化钠和86 mg碲粉置于反应瓶中，加入5 mL蒸馏水溶解，冰水浴中还原反应8 h，得到紫色碲氢化钠水溶液。在250 mL三口烧瓶中加入286 mg氯化镉，用100 mL蒸馏水溶解，磁力搅拌下加入220 μL巯基乙酸，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值至11.0，通氮除氧30 min后，剧烈搅拌下加入新制备的碲氢化钠水溶液，100 ℃水浴回流2 h，得到1.0 mmol/L巯基乙酸修饰的CdTe量子点溶液(以HTe-浓度计算)。

1.3 卡那霉素的测定

在5 mL比色管中，依次加入0.5 mL 35 μmol/L CdTe量子点溶液、0.5 mL 500 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.5)及一定量的1.0 mg/mL卡那霉素标准溶液，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。室温下放置10 min后，在波长差△λ=230 nm、激发和发射狭缝宽度均为5 nm条件下，进行同步荧光光谱扫描，分别测定加入卡那霉素标准溶液前后体系的同步荧光强度F0和F，计算体系相对同步荧光强度△F=F-F0。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱特性分析

人体尿液中含有多种有机物质，其中一些物质具有很强的荧光，图1为尿液和CdTe量子点的荧光光谱。从图1可知，采用常规荧光光谱法时，尿液中复杂基质的荧光光谱与CdTe量子点的荧光光谱重叠严重，从而对CdTe量子点的荧光强度有很大干扰，难以实现CdTe量子点对尿液中卡那霉素含量的直接测定。

采用同步荧光光谱法，可避免尿液中复杂基质的荧光干扰，而波长差直接影响其选择性和灵敏度。在不同波长差△λ条件下，分别测定尿液、CdTe量子点及卡那霉素-CdTe量子点-尿液体系的同步荧光光谱。结果发现，当波长差△λ=230 nm时，CdTe量子点同步荧光峰位于334 nm处，而尿液中复杂基质同步荧光峰位于228 nm处，此时二者重叠较少，从而避免尿液中复杂基质对CdTe量子点同步荧光强度的干扰；同时当卡那霉素加入CdTe量子点-尿液体系后，体系同步荧光峰位不变，但卡那霉素对CdTe量子点同步荧光的增强效应最大(见图2)。因此实验选择波长差△λ=230 nm测定体系的同步荧光强度。

2.2 pH值的选择

考察Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液对体系相对同步荧光强度△F的影响，结果发现在Tris-HCl缓冲液中，△F最大且相对稳定。同时，考察Tris-HCl缓冲液pH值对体系相对同步荧光强度△F的影响，结果发现随着Tris-HCl缓冲液pH值的增加，△F先增大后减小；当pH值为7.5时，△F达到最大值。因此实验选择加入pH值7.5的Tris-HCl缓冲液。

2.3 CdTe量子点浓度的选择

考察CdTe量子点浓度对体系相对同步荧光强度△F的影响，结果如图3所示。由图3可知，随着CdTe量子点浓度的增加，△F逐渐增大；当CdTe量子点浓度为3.5 μmol/L时，△F达到最大值；继续增大其浓度，△F反而逐渐降低。考虑到灵敏度和信噪比，实验选择CdTe量子点浓度为3.5 μmol/L。

2.4 反应时间及稳定性的选择

考察反应时间对体系相对同步荧光强度△F的影响。结果表明，CdTe量子点与卡那霉素反应10 min后，△F达到稳定，且在30 min内保持不变。因此实验选择10 min后测定体系的相对同步荧光强度。

2.5 方法的线性范围及检出限

在优化实验条件下，CdTe量子点溶液中加入Tris-HCl缓冲液及一系列浓度的卡那霉素标准溶液，按实验方法测定CdTe量子点的同步荧光光谱，并以卡那霉素浓度对体系相对同步荧光强度△F绘制工作曲线，结果如图4所示。由图4可知，卡那霉素浓度在0.2～20.0 μg/mL范围内与△F呈良好的线性关系，回归方程为：△F=0.69148+3.15729c，相关系数为0.9996。根据IUPAC的规定，以3S0/S计算出此方法的检出限为0.005 μg/mL。

2.6 实际样品的测定

取肌肉注射200 mg卡那霉素健康受试者1 h(1#)和4 h(2#) 的尿液样品，8 000 r/min离心10 min，取上清液置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。按实验方法测定尿液样品的同步荧光强度，同时进行加标回收实验，结果如表1所示。由表1可知，加标回收率在96.3%～104.4%之间，相对标准偏差(RSD)为1.6%～2.4%，表明该方法可用于尿液样品中卡那霉素含量的直接测定。

表1 尿液样品中卡那霉素的测定结果(n=6)

3 结论

采用同步荧光光谱法，通过选择合适的波长差△λ=230 nm，从而避免尿液中复杂基质的荧光干扰。基于卡那霉素显著增强CdTe量子点的荧光强度，建立一种直接测定尿液中卡那霉素含量的同步荧光光谱法。在优化实验条件下，卡那霉素浓度在0.2～20.0 μg/mL范围内与体系相对同步荧光强度呈良好线性关系，相关系数和检出限分别为0.9996和0.005 μg/mL。该方法只需对尿液样品进行简单处理，即可实现尿液样品中卡那霉素含量的定量测定，有望成为卡那霉素含量的常规测定方法。