春雷霉素与叶枯唑对黄瓜细菌性角斑病菌的联合毒力

姜珊珊 辛志梅 吴斌 张眉 王升吉 辛相启

摘要：为明确春雷霉素（Kasugamycin）与叶枯唑（Bismerthiazol）混配对黄瓜细菌性角斑病菌（Pseudomonas syringe pv.lachrymanas）的增效作用及最佳配比，采用浑浊度法测定了春雷霉素与叶枯唑混配对黄瓜细菌性角斑病菌的毒力。结果表明：春雷霉素、叶枯唑对黄瓜细菌性角斑病菌的EC50分别为8.739、39.227 mg·L-1，春雷霉素对黄瓜细菌性角斑病菌的室内生物活性明显高于叶枯唑；春雷霉素与叶枯唑混配对黄瓜细菌性角斑病菌表现为增效作用，5个配比中，1∶5配比的SR为1.71，增效作用最明显。

关键词：春雷霉素；叶枯唑；黄瓜细菌性角斑病菌；联合毒力；增效作用

中图分类号：S482.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）09-0103-04

AbstractIn order to clarify the synergistic effects of kasugamycin and bismerthiazol to Pseudomonas syringae pv. lachrymans， and to find the best mixture ratio of two preparations， the toxicities of kasugamycin and bismerthiazol and their mixtures at five different ratios against P. syringae were tested by turbidity method. The results showed that the EC50 of P. syringae were 8.739 mg·L-1 and 39.227 mg·L-1，respectively， when affected by kasugamycin and bismerthiazol， and the indoor toxicity of kasugamycin was obviously higher than that of bismerthiazol. There was synergism between kasugamycin and bismerthiazol. In the 5 different mixture ratios， the ratio of 1∶5 with the synergistic coefficient as 1.71 had the strongest synergistic effect.

KeywordsKasugamycin； Bismerthiazol； Pseudomonas syringae； Combined toxicity； Synergistic effect

黄瓜细菌性角斑病（Pseudomonas syringe pv. lachrymanas）是黄瓜生产中的重要病害之一，可为害叶、叶柄、瓜蔓及果实，在適宜条件下，可迅速扩展蔓延，造成叶片干枯、果实腐烂，一般减产30%～50%，严重时损失高达50%～60%，甚至绝收。保护地栽培环境条件有利于黄瓜细菌性角斑病的发生与流行[1，3]，随着保护地面积的扩大，该病害造成的经济损失日益加重。

当前我国针对黄瓜细菌性角斑病的高抗品种及种质资源比较缺乏[4，5]，药剂防治是控制该病害的重要措施。目前已经登记的用于防治该病害的药剂主要有琥胶肥酸铜（Copper）、中生菌素（Zhongshengmycin）等7种单剂，且防效一般[6，7]。面对日益严峻的防治压力，探索和研究高效低毒的复配药剂成为一种途径。据报道，辛菌胺醋酸盐、中生菌素、春雷霉素、甲磺酰菌唑等与其他杀菌活性物组合的复配药剂的防效皆高于单剂。

结构类型不同的杀菌剂复配使用是提高防效、延缓抗药性发展、降低用药成本的重要途径[8]。药剂之间不同配比的联合作用效果评价是杀菌剂复配的基础研究工作。鉴于此，本研究测定了春雷霉素与叶枯唑单剂及其5种复配组合对黄瓜细菌性角斑病菌的毒力，明确不同配比对该病菌的联合作用类型，以期为复配药剂的研制提供科学依据。

1材料与方法

1.1供试病原菌

黄瓜细菌性角斑病病叶采自山东省泰安市，在山东农业科学院植物保护研究所实验室经NA（nutrient agar）培养基培养，常规组织分离法分离、纯化、鉴定获得供试菌株，按照柯赫氏法则（Kochs Rule）[9]进行致病性测定后保存备用。

1.2供试药剂

65%春雷霉素原药、90%叶枯唑原药，由山东海立信农化有限公司提供。

1.3试验方法

1.3.1药液的配制春雷霉素原药直接用水稀释；叶枯唑原药先用二甲基甲酰胺溶解，后用含0.1%吐温-80的水溶液稀释。采用逐级稀释法配制各质量浓度的药液。春雷霉素和叶枯唑2种单剂及5种混剂组合（春雷霉素∶叶枯唑为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7）均设7个系列质量浓度，其中春雷霉素单剂及5种混配组合质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg·L-1，叶枯唑单剂质量浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 mg·L-1。以药剂有效成分在培养基中的浓度为测试浓度[10]，药液浓度为测试浓度的25倍。

1.3.2菌液的配制将供试病菌菌株活化培养24 h，用无菌水稀释成107 cfu·mL-1的菌液。

1.3.3菌悬液的配制将NB（nutrient broth）培养基定量（24.0 mL）分装于玻璃瓶中，高温灭菌。在无菌条件下，用微量移液器从低浓度到高浓度依次向每瓶内注入1.0 mL药液。空白对照注入1.0 mL 0.1%吐温-80无菌水。用灭菌吸管取0.1 mL菌液，接种到上述培养基中，充分摇匀。每处理重复4次。

1.3.4细菌生长量测定取空白灭菌培养液一瓶，注入1.0 mL 0.1%吐温-80无菌水，做标准样品用于校正分光光度计零点，调零后该培养液置于1～3℃冰箱内保存。

用752型分光光度计测定各处理菌悬液初始OD600值（600 nm光密度值），记为“培养前OD600值”。然后置于24℃条件下振荡培养（120 r/min），待空白对照处理达到对数生长期（培养24 h）时，测定并记载各处理菌悬液OD600值，记为“培养后OD600值”。

调查方法参照农业行业标准NY/T 1156.16—2008《农药室内生物测定试验准则杀菌剂第16部分：抑制细菌生长量试验浑浊度法》[11]。

按式（1）、（2）计算生长抑制率：

OD600增加值=培养后OD600值-培养前OD600值（1）

生长抑制率（%）=（1- 药剂处理OD600增加值/空白对照OD600增加值）×100（2）

1.4统计分析

以药剂浓度对数值为自变量x、以生长抑制率的几率值为因变量y作回归分析，求出毒力回归方程（y=a+bx）和相关系数（r），计算各药剂的EC50及其95%置信限。

按Wadley法，计算增效系数（SR）；根据SR值评价药剂混用的联合作用类型，即SR<0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR>1.5为增效作用，公式如式（3）、（4）。

SR=EC50（th）EC50（ob）（3）

EC50（th）=a+baEC（A）50+bEC（B）50（4）

式中：A、B分别为春雷霉素、叶枯唑单剂，a、b为相应单剂在混剂中的比例，EC50（th）为混剂EC50理论值，EC50（ob）为混剂EC50实测值。

2结果与分析

2.1春雷霉素、叶枯唑单剂对靶标病菌生长的影响

春雷霉素浓度为0.1～100.0 mg·L-1时，对黄瓜细菌性角斑病菌的生长抑制率为7.48%～78.55%；叶枯唑浓度为0.5～200.0 mg·L-1时，对黄瓜细菌性角斑病菌的生长抑制率为7.25%～62.38%，详见表1。

2.3对靶标病菌的毒力及联合作用类型

表3数据表明，春雷霉素和叶枯唑对黄瓜细菌性角斑病菌的EC50分别为8.739 mg·L-1、39.227 mg·L-1，春雷霉素对黄瓜细菌性角斑病菌的室内生物活性明显高于叶枯唑。春雷霉素与叶枯唑的配比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的SR值分别为1.60、1.65、1.71、1.67、1.66，均大于1.5，表明上述5种混配组合对黄瓜细菌性角斑病菌都表现为增效作用，二者比例为1∶5时，SR值最大，增效作用最明显。

3讨论与结论

本试验结果表明，叶枯唑对黄瓜细菌性角斑病菌的EC50值为春雷霉素的4倍多，说明春雷霉素抑制黄瓜细菌性角斑病菌生长的作用明显强于叶枯唑。关于药剂对黄瓜细菌性角斑病菌室内毒力测定研究少见报道，本研究可为筛选防治该病害的高效低毒药剂提供参考。

从春雷霉素和叶枯唑以及二者不同配比混配对黄瓜细菌性角斑病菌抑制率的回归方程可以看出，b值都小于1，表明相对于抑菌率的增加，药剂浓度的增加速度更快，从而导致EC90值会较大。据此推测，当田间病害大发生时用药，防治效果欠佳。因此，应用春雷霉素和叶枯唑及其混配药剂防治黄瓜细菌性角斑病菌时，要注意合理选择用药时机，应在病害初发生时及时施药。

从春雷霉素与叶枯唑不同比例混配对黄瓜细菌性角斑病菌的联合作用类型结果可以看出，春雷霉素和叶枯唑以1∶5配比混配，SR值1.71，增效作用最明显。张少武等[12]也进行了春雷霉素与叶枯唑对黄瓜细菌性角斑病菌的联合作用研究，春雷霉素与叶枯唑以5∶1、4∶6.25、3∶12.5、2∶18.75、1∶25五种配比混合，SR值分别为1.22、1.35、1.47、1.45、1.35，与本文结果基本一致，但由于配比设置跨度大，使确定最优配比的参考价值不足。本研究对配比进一步细化，同时获取各混配比例的防效，为复配制剂的研发提供依据。

不同作用位点的药剂混配能增强对病菌生长的干扰而具有增效作用，是药剂复配的基本原则之一。春雷霉素是由春雷链霉素产生的氨基糖苷类抗生素，主要干扰氨基酸的代谢酯酶系统，从而影响蛋白质合成，抑制菌丝伸长和造成细胞颗粒化，作用位点在细胞30S核糖体亚单位的16S rRNA解码区的A部位[13]。叶枯唑属噻二唑类内吸性杀菌剂，在细菌体内对细胞代谢过程中的烟酰胺产生拮抗作用，抑制病菌细胞的蛋白质合成而不能进行正常的代谢活动，作用机理是由于取代了辅酶Ⅰ（COI）中的烟酰胺而造成辅酶Ⅰ的合成和利用失调，最终影响了DNA和RNA的合成[14]。春雷霉素与叶枯唑作用位点不同，符合药剂复配的基本原则。

春雷霉素与叶枯唑均低毒，兼具保护和治疗作用，具有较强的内吸性，尤其是春雷霉素能被植物主动吸收转运，具有优良特性[15]，应用前景广阔。但是叶枯唑不稳定，见光易分解，代谢产物有致畸作用和甲状腺毒性，存在潜在风险[16]。因此，选用叶枯唑及含有该成分的复配剂防治细菌病害时，应控制施药剂量并严格执行安全间隔期制度。同时，提高叶枯唑稳定性可作为未来研究的方向。

在自然条件下，由于药剂对病害的作用效果还要受田间环境因素和其他害虫发生情况等因素的影响，室内测定结果与田间实际防治效果可能存在一定差异，本研究为田间实际防效提供了参考，田间防效还需根据实际情况进一步验证。

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