PI3K/Akt信号通路对布鲁氏菌介导的细胞凋亡基因表达的影响

印双红 张俊波 罗静 冉辉 李建新 陆安法 郭飞 陈创夫

摘要[目的]研究阻断PI3K/Akt信号通路对布鲁氏菌介导的细胞凋亡的影响。[方法]用抑制剂LY294002（LY）作用于细胞1 h，然后将布鲁氏菌16 M侵染细胞，应用实时定量PCR检测16 M对巨噬细胞内凋亡相关基因Caspase3活性和Bax mRNA表达的影响。[结果]阻断PI3K/Akt信号通路可显著提高16 M介导的caspase3活性和Bax mRNA水平。[结论]PI3K/Akt信号通路可调控布鲁氏菌介导的细胞凋亡。

关键词 PI3K/Akt信号通路；布鲁氏菌；细胞凋亡

中图分类号 S188+.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-162-02

Abstract[Objective]To detect the changes of Brucella mediated apoptosis genes regulated by PI3K/Akt signal pathway.[Method]Inhibitor LY294002（LY） was applied on cells for 1 h.Brucella 16 M was applied to infect the cells.Real time quantitative PCR was used to detect the effects of 16M on macrophage apoptosis related gene Caspase3 activity and Bax mRNA expression.[Result]Blocking PI3K/Akt signal pathway could significantly enhance the Caspase3 activity and Bax mRNA level mediated by 16M.[Conclusion]PI3K/Akt signal pathway can regulate the Brucella mediated apoptosis.

Key words PI3K/Akt signal pathway； Brucella； Apoptosis

布鲁氏菌病是一种严重危害人和家畜健康的人兽共患传染病[1-2]。布鲁氏菌为革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌，其急性期的临床特点主要为恶寒、发热、关节和肌肉痛等；人感染布鲁氏菌后造成骨关节、神经系统、生殖系统和免疫系统等损害，慢性期主要症状为骨关节病及包括神经系统在内的多系统多器官的损害，患者一般会表现出神经-精神症状，病程较长，容易复发并再感染，从而导致劳动力丧失。动物布鲁氏菌病的特点是生殖器官、胎膜及其他多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、睾丸炎及关节炎等症状。布鲁氏菌病给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重危害[3]。因此，研究布鲁氏菌及对宿主细胞的致病机制，为布鲁氏菌疫苗研发和和防控提供理论基础，对于国民经济的发展和社会的安全具有重大意义。

PI3K/Akt信号转导通路是重要的细胞生存通路之一，Akt作为PI3K/Akt信号转导通路的关键分子，在促进细胞生存、生长、增殖，促进细胞运动、侵袭和转移，抑制细胞凋亡方面起核心作用[4]。PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤组织有Akt的过度表达和活化。PI3K/Akt信号通路还与一些病毒的生存繁殖密切相关，然而，PI3K/Akt信号通路与布鲁氏菌的生存关系如何，目前尚无相关报道。笔者研究阻断PI3K/Akt信号通路对布鲁氏菌介导细胞凋亡的影响，有助于揭示布鲁氏菌的致病机制，为抗布鲁氏菌药物的研制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞与质粒。牛种布鲁氏菌参考株2308和牛种布鲁氏菌疫苗株RB51由石河子大学人畜共患病实验室提供，大肠杆菌DH5a由铜仁学院生物与农林工程学院细胞生物学实验室保存。

1.1.2 主要试剂。胎牛血清购自GIBCO公司；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）、NaCl购自Oxoid公司；琼脂糖购自上海生物工程技术有限公司；DMSO 购自索莱宝公司；LY 购自碧云天公司；Caspase3活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；SYBR染料购于罗氏公司。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7。将16M用PBS洗脱菌体，利用细菌比浊法计算数量，按比例将菌悬液稀释10倍，然后将菌悬液涂于固体培养基上，置于37 ℃、10% CO2培养箱中培养3 d，每个稀释浓度重复3次，取平均值确定布鲁氏菌数目。以50∶1（细菌个数：细胞个数）的比例，用16M侵染RAW264.7细胞，并将侵染后的RAW264.7细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。

1.2.2 Caspase3活性测定。先用抑制剂LY（20 μmol/L）与巨噬细胞作用1 h，然后将羊种布鲁氏菌侵染RAW264.7巨噬细胞，按50∶1（细菌个数∶细胞個数）进行侵染细胞，并将侵染的RAW264.7细胞继续置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，PBS洗涤3次。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。4 ℃、1 000 r/min离心5 min收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量无细胞被吸除，PBS洗涤一次。吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。然后制作标准曲线，按照操作说明，测定其活性。

1.2.3 LY抑制试验。取对数生长期细胞，在10% FBS培养基中取2 mL细胞以1×106个/mL密度接种于六孔培养板中。继续培养6 h后，加入10、20、40 μmol/L LY，1 h后观察pAkt（S473）和pAkt（T308）的抑制状态。方法是将细胞混悬液立即置入液氮以终止作用，继以冰冻PBS洗涤细胞3次。细胞收集后，采用1×106个/50 μL RIPA提取总蛋白质，BCA法测定总蛋白浓度。

1.2.4 Bax基因引物设计。从NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站GenBank上查找鼠的凋亡相关基因，设计引物。引物序列Bax上游5′GCCTTTTTGCTACAGGGTTTC 3′，Bax下游5′TTGCTGTCCAGTTCATCTCCA3′；βactin上游5′GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT3′，βactin下游5′CAGCACTGTGTTGGCATAGA3′。

1.2.5 Bax基因表达检测。

实时定量PCR反应体系20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每组细胞每个时间点的细胞做3个重复，采用2-ΔΔCt 法对试验数据进行分析。

1.3 数据分析 使用SPSS 17.0数据统计软件对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 阻断PI3K/Akt信号通路对16M介导caspase3 活性的影响

先用抑制剂与细胞孵育1 h，然后， 用16M侵染细胞4、12和24 h， 用试剂盒分别检测caspase3的活性。结果表明，在4、12和24 h，16M+LY组细胞caspase3的活性（OD405）均显著高于对照组细胞（P<0.05）（图1）。这表明抑制剂LY可提高16M介导的caspase3 活性，从而诱导16M介导的细胞凋亡，LY可提高16M介导的凋亡主要依赖caspase3的活性。同时，仅抑制剂LY作用于细胞并不改变caspase3的活性，表明抑制剂LY本身不诱导细胞凋亡。

2.2 阻断PI3K/Akt信号通路对16M介导Bax mRNA表达量的影响

先用抑制剂LY与细胞孵育1 h，然后，用16M侵染细胞4、12和24 h后，Trizol法提取细胞总RNA，实时定量PCR检测凋亡相关基因Bax的mRNA相对表达量。结果表明，在4、12和24 h，16M+LY组细胞中Bax的 mRNA相对表达量显著高于对照组细胞（P<0.01）（图2）。而16M+LY组细胞中Bax的mRNA相对表达量显著高于16M组细胞（P<0.01）；在4、12和24 h，16M组细胞和LY组细胞中Bax的mRNA相对表达量与对照组均无显著差异（P>0.05）。这表明，在4、12和24 h，抑制剂LY提高了16M介导的促凋亡基因Bax的mRNA水平。

3 讨论

PI3K/Akt信号通路与很多疾病有关[5]，在细胞内参与调控物质代谢、细胞增殖与存活等生物学行为。

细胞凋亡是近年来的研究热点，细胞凋亡的信号转导途径为多种免疫疾病的研究提供了一个新的思路。细胞凋亡是一种由内源性多基因控制的、主动的程序化细胞死亡过程。目前，许多细菌（立克次氏体、脑膜炎双球菌、伤寒沙门菌）在宿主内的持续感染都与细胞凋亡密切相关[6-8]。Akt是PI3K最主要的靶酶，與多种细胞活动、物质代谢调节，尤其是与抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、介导细胞周期有密切关系[9]。LY （PI3 Kinase Inhibitor）是一个高度特异性的抑制剂，可以特异地抑制 PI3 kinase的活性，但不抑制其他脂质和蛋白激酶活性。研究表明LY可以抑制 PI3K依赖的Akt磷酸化和激酶活性，它通过和ATP竞争PI3K催化结构域的结合位点发挥作用[10]，从而有效抑制其下游蛋白Akt的磷酸化，已被广泛应用于信号转导通路的作用及靶向治疗的研究。

布鲁氏菌在宿主细胞中的复制和增殖受到多种因素的影响。为了在宿主细胞中复制和增殖，布鲁氏菌通过激活宿主细胞内信号通路控制宿主细胞的存活、凋亡和自噬，以逃避宿主免疫应答。研究表明，某些病毒为了更加有效地进行复制，通过激活PI3K/Akt信号通路抑制宿主细胞的早期凋亡、促进细胞自噬和抑制细胞免疫以延长在胞内的复制时间[11-13]，甲型流感病毒的NS1蛋白可与PI3K的p85β亚基结合而激活PI3K/Akt。但PI3K/Akt是否在布鲁氏菌感染中起作用尚未见报道。该研究表明，由于凋亡相关基因caspase3和Bax的表达都发生变化，且这2个凋亡基因都属于线粒体通路上的关键分子，因此，该研究推测PI3K/Akt信号通路主要通过线粒体通路发挥调控布鲁氏菌16M介导的细胞凋亡，其具体机制还有待于进一步探索。

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