烟嘧磺隆人工抗原的合成与鼠源多克隆抗体的制备

李潇潇，尤会会，郭　晴，杜俊婷，丁书茂，杨　旭，袁均林

(华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079)



烟嘧磺隆人工抗原的合成与鼠源多克隆抗体的制备

李潇潇，尤会会，郭晴，杜俊婷，丁书茂，杨旭，袁均林

(华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079)

为了制备烟嘧磺隆的多克隆抗体、建立烟嘧磺隆残留的免疫分析方法，以2-氨基磺酰基-N,N-二甲基烟酰胺(ASDM)和琥珀酸酐为原料合成半抗原，采用活泼酯法制备人工抗原并免疫小鼠。结果表明：经紫外可见吸收光谱扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，人工抗原合成成功，半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)的偶联比分别为10.5∶1和26.9∶1。5次免疫后小鼠抗血清的效价均达到1∶16 000以上，以ASDM-BSA为免疫原的小鼠产生了抑制烟嘧磺隆的多克隆抗体，建立的间接竞争ELISA方法对烟嘧磺隆的检测范围是1 ng·mL-1～10 μg·mL-1。为进一步建立更为高效、灵敏和方便的烟嘧磺隆ELISA检测方法提供了参考。

烟嘧磺隆；人工抗原；多克隆抗体；ELISA

农药的使用促进了现代农业的快速发展。磺酰脲类除草剂因具有高效、低毒和性价比高等特点，应用非常广泛[1]。烟嘧磺隆(nicosulfuron)，又名玉农乐，是1987～1988年由日本石原产业公司与美国杜邦公司联合开发的一类磺酰脲类除草剂，可有效去除玉米田中多种禾本科杂草以及阔叶杂草，作用原理是通过抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的合成，导致杂草体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，最终杂草因细胞分裂受阻，生长停滞而枯死[2]。研究表明，土壤对烟嘧磺隆的吸附性较弱，使其流动性较高，很容易污染地下水[3-4]，且生产此类除草剂的农药厂所排放的废水中也含有较高浓度的烟嘧磺隆[5]，对环境造成严重污染。因此，烟嘧磺隆残留的问题逐渐引起人们的关注。

目前，烟嘧磺隆的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等，但这些方法都需要使用大型仪器，样品的制备及分离耗时耗力，费用昂贵。酶联免疫吸附测定(ELISA)法因具有方便、灵敏和快速的优点可以弥补上述方法的不足，被广泛地应用于临床试验与化学物质分析中[6]。作者通过合成烟嘧磺隆人工抗原，成功制备出烟嘧磺隆多克隆抗体，旨在为建立烟嘧磺隆的ELISA方法提供参考。

1　实验

1.1材料、试剂与仪器

雌性BALB/c小鼠，6周龄，湖北省实验动物研究中心。

烟嘧磺隆(纯度为95%)、丁二酸酐，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体IgG，Jackson公司；卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)，Sigma公司；2-氨基磺酰基-N,N-二甲基烟酰胺(ASDM，纯度98%)，北京百灵威公司；二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，成都西亚试剂公司；低分子量Marker，北京天根生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

Eppendorf5415R型低温冷冻离心机，Beckman公司；UV-2700型紫外可见分光光度计，Shimadzu公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂；酶标分析仪，北京普朗新公司。

1.2方法

1.2.1人工抗原的合成

烟嘧磺隆分子结构中不含活泼基团，结构比较稳定，采用烟嘧磺隆分子一半结构的化合物ASDM来合成人工抗原，合成路线如图1所示：

图1烟嘧磺隆人工抗原的合成路线

Fig.1Synthetic route of nicosulfuron artificial antigen

参照文献[7]合成人工抗原ASDM-OVA，并做适当的改进。将46 mg ASDM与20 mg琥珀酸酐溶于3 mL二甲基甲酰胺(DMF)中搅拌过夜，加入23 mg NHS和41.23 mg DCC，继续搅拌12 h。称取50 mg OVA 用10 mL 0.2 mol·L-1pH 值9.0硼酸盐缓冲液溶解，将上述反应液逐滴加入到蛋白溶液中，继续搅拌反应12 h，3 000 r·min-1离心5 min。将上清液放入透析袋中，于4 ℃PBS缓冲液中透析72 h，期间每隔12 h更换一次PBS缓冲液，收集透析袋内液体，得到人工抗原ASDM-OVA。

将OVA更换为BSA，同法合成人工抗原ASDM-BSA。

1.2.2人工抗原的鉴定

1.2.2.1紫外可见吸收光谱扫描

用PBS缓冲液调零，将ASDM稀释至一定倍数时即可进行紫外可见吸收光谱扫描获得清晰的光谱，然后将BSA、OVA和两种人工抗原均稀释至1 mg·mL-1进行紫外可见吸收光谱扫描。

1.2.2.2SDS-PAGE鉴定

配制10%的分离胶和4%的浓缩胶，电泳完毕后用考马斯亮蓝R-250染色45 min，用脱色液洗脱至胶的背景接近透明时，凝胶成相。

1.2.3小鼠的免疫及烟嘧磺隆多克隆抗体的制备

将6只雌性BLAB/c小鼠随机分成2组：ASDM-OVA免疫组和ASDM-BSA免疫组。初次免疫将人工抗原与FCA等体积混合并充分乳化，免疫用量为每只100 μg。4周后进行第二次免疫，用等体积FIA乳化，免疫用量为每只50 μg，以后每隔2周按第二次免疫方法重复免疫一次，第5次免疫结束后的第7 d，将小鼠断尾取血，收集血清。用间接ELISA方法检测其效价，用间接竞争ELISA方法对其灵敏度进行检测[8]。

2　结果与讨论

2.1紫外可见吸收光谱(图2)

图2 紫外可见吸收光谱

由图2可知，ASDM、载体蛋白和人工抗原的紫外可见吸收光谱不同。ASDM的最大吸收峰在264.3 nm处；OVA、ASDM-OVA的最大吸收峰分别在279.0 nm、277.8 nm处;而BSA、ASDM-BSA的最大吸收峰分别在278.0 nm、276.8 nm处。两种人工抗原与载体蛋白相比波峰均有所偏差，证实ASDM与载体蛋白偶联成功。

2.2人工抗原的SDS-PAGE图谱(图3)

图3　人工抗原的SDS-PAGE图谱

从图3可以看出，第3和第5泳道的人工抗原与第2和第4 泳道相应的载体蛋白相比明显滞后，表明ASDM与载体蛋白偶联成功。

根据标准蛋白Marker的迁移距离得到蛋白相对分子质量对数值与电泳相对迁移率的标准曲线，见图4。

图4　蛋白相对分子质量对数值与电泳相对迁移率标准曲线

由图4的标准曲线计算人工抗原ASDM-OVA的相对分子质量为48 450.69，人工抗原ASDM-BSA的相对分子质量为74 851.41，而两种载体蛋白OVA、BSA的相对分子质量分别为45 kDa和66 kDa，计算可得ASDM与OVA和BSA的偶联比分别为10.5∶1和26.9∶1。

2.3抗血清的效价及灵敏度的检测

以其中一种人工抗原为免疫原时则用另一种人工抗原作为包被抗原，以0.5 μg·mL-1的浓度包被时测得第5次免疫后小鼠血清OD值如表1所示。以OD值约为1时的血清稀释倍数作为小鼠抗血清的效价(即中点效价)。

表1小鼠抗血清效价

Tab.1　Titer of mice antiserum

由表1可知，ASDM-OVA免疫组3只小鼠抗血清效价分别为1∶32 000、1∶64 000和1∶128 000；ASDM-BSA免疫组小鼠抗血清效价分别为1∶32 000、1∶32 000和1∶16 000，可见所有免疫的小鼠均产生较高效价的抗体。确定所有小鼠的效价后，设置浓度梯度为10 μg·mL-1、1 μg·mL-1、10-1μg·mL-1、10-2μg·mL-1、10-3μg·mL-1和10-4μg·mL-1的烟嘧磺隆溶液对每只小鼠的抗血清进行灵敏度检测。结果发现，虽然ASDM-OVA作为免疫原产生了高效价的抗体，但其抑制效果不明显，检测不到灵敏度；而以ASDM-BSA作为免疫原的2号和3号小鼠的抗血清能对烟嘧磺隆产生抑制，且3号小鼠的抑制效果最好，进一步证实两种人工抗原合成成功，也表明成功制备出烟嘧磺隆的多克隆抗体。

采用1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.125 μg·mL-1的包被浓度对3号小鼠的抗血清进行灵敏度检测，发现不同的包被浓度对抑制率并没有太大的改变，而且较低浓度的包被抗原会降低抗原的最大抑制率的检测浓度，即检测上限。本研究发现以0.5 μg·mL-1的包被浓度检测灵敏度时得出的标准曲线线性关系最好。3号小鼠的抗血清对烟嘧磺隆的标准抑制曲线如图5所示。

由图5可知，在1 ng·mL-1～10 μg·mL-1范围内抑制率与烟嘧磺隆浓度对数值呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.0768lgc+0.2979，R2=0.9954。

2.4讨论

农药等小分子物质不具有免疫原性，必须通过与蛋白质等大分子物质偶联才有可能使机体产生相应的抗体，因此，合成人工抗原是多克隆抗体制备的关键步骤。为了使小分子物质连接到载体蛋白上时能够充分

图5　烟嘧磺隆标准抑制曲线

暴露其抗原决定簇，需要用一定长度的“连接臂”使半抗原与载体蛋白偶联。磺酰脲类除草剂的分子结构特点是中间含有一个磺酰脲桥结构，两端连接芳环和杂环。Zhao等[9]以戊二醛作交联剂，将苄嘧磺隆分子与载体蛋白偶联，成功制备出两种人工抗原，最终用制备的单克隆抗体建立了苄嘧磺隆的间接竞争ELISA检测方法。烟嘧磺隆的分子结构与苄嘧磺隆类似，其脲桥两端分别连接两个不同结构的杂环，由于两侧基团电荷分布不均匀，理论上脲结构中两个亚氨基上的氢可以被取代。

在对磺酰脲类除草剂人工抗原合成方法的探索中，研究人员采用农药分子一半的结构与琥珀酸酐反应合成半抗原，使其连上一个含有4个C原子的羧基，再采用活泼酯法进行人工抗原的合成，最终成功制备出苄嘧磺隆、甲磺隆和氯嘧磺隆的抗体[10-12]。本研究也采取活泼酯法合成烟嘧磺隆人工抗原，ASDM不仅是烟嘧磺隆分子结构的一半，而且其结构上含有一个活泼氨基，可与琥珀酸酐反应生成半抗原。在半抗原合成过程中往往要对生成的产物进行萃取、蒸馏、重结晶和质谱鉴定等一系列复杂的操作，而本研究选用DMF作溶剂，将加入的ASDM和琥珀酸酐长时间搅拌后直接加到蛋白溶液中合成人工抗原，省去了上述复杂的操作流程。人工抗原经SDS-PAGE和紫外可见吸收光谱检测，结果表明偶联成功。小鼠经免疫后获得了对烟嘧磺隆产生抑制的抗血清，不仅证明人工抗原的合成成功，而且表明对此种方法的改进是可行的。

以ASDM-OVA作为免疫原的小鼠抗血清效价均达到1∶32 000以上，而以ASDM-BSA作为免疫原的小鼠最高效价才达到1∶32 000，从产生抗体效价的角度来看，以OVA为载体蛋白的免疫效果更好。小鼠抗血清产生较高的效价说明产生的抗体与包被抗原具有良好的结合能力，通过检测并计算抑制率可判定抗体能否被小分子识别，从而最终证明所需要的目标抗体是否产生。本研究结果表明，以ASDM-BSA为免疫原的小鼠产生了能够识别烟嘧磺隆的多克隆抗体，所以在人工抗原合成后都要作为免疫原进行测试，研究其免疫效果；并且免疫的动物数量要尽可能多一些，从而避免动物的个体差异对实验结果造成影响。

所合成抗体对烟嘧磺隆的最高抑制率只有38%，可能的原因是ASDM连接到蛋白上作为抗原决定簇使被免疫的小鼠不仅产生能与烟嘧磺隆结合的抗体，而且还产生了ASDM与连接臂相结合，或者连接到载体上的其它小分子的抗体，从而使多克隆抗体中非目标抗体的含量增加。该多抗建立的间接竞争ELISA检测方法对烟嘧磺隆具有良好的检测效果，检测范围为1 ng·mL-1～10 μg·mL-1，其最低检测限为1 ng·mL-1，低于UPLC-MS/MS方法的最低检测残留量0.01 mg·L-1[13]。

3　结论

以烟嘧磺隆分子结构的一半的物质ASDM和琥珀酸酐为原料，以DMF为反应溶剂直接合成半抗原，反应产物不需要复杂的提纯与鉴定程序就可以直接与载体蛋白进行偶联。免疫小鼠后获得高效价并具有灵敏度的抗血清，证实该方法合成人工抗原的可行性，不仅为烟嘧磺隆多克隆抗体的制备与ELISA检测方法的建立提供条件，也为合成含有氨基基团的小分子的人工抗原提供了更便捷的技术。

[1]张敏恒.磺酰脲类除草剂的发展现状、 市场与未来趋势[J].农药，

2010，49(4):235-240.

[2]KARPOUZAS D G，PAPADOPOULOU E，IPSILANTIS I，et al.Effects of nicosulfuron on the abundance and diversity of arbuscular mycorrhizal fungi used as indicators of pesticide soil microbial toxicity[J].Ecological Indicators，2014，39(4):44-53.

[3]张伟，王进军，张忠明，等.烟嘧磺隆在土壤中的吸附及与土壤性质的相关性研究[J].农药学学报，2006，8(3):265-271.

[4]REGITANO J B，KOSKINEN W C.Characterization of nicosulfuron availability in aged soils[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(14):5801-5805.

[5]KANG Z H，DONG J G，ZHANG J L.Optimization and characterization of nicosulfuron-degrading enzyme fromBacillussubtilisstrain YB1[J].Journal of Integrative Agriculture，2012，11(9):1485-1492.

[6]QIAN G，WANG L，WU Y，et al.A monoclonal antibody-based sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the analysis of the organophosphorous pesticides chlorpyrifos-methyl in real samples[J].Food Chemistry，2009，117(2):364-370.

[7]ZHAO J，LI G，YI G X，et al.Comparison between conventional indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) and simplified icELISA for small molecules[J].Analytica Chimica Acta，2006，571(1):79-85.

[8]LIU W，ZHAO C，ZHANG Y，et al.Preparation of polyclonal antibodies to a derivative of 1-aminohydantoin (AHD) and development of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in water[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(17):6829-6834.

[9]ZHAO J，YU X，LUO Q，et al.Anti-bensulfuron methyl monoclonal antibody production and BSM-detecting indirect competitive enzyme-linked immunoassay establishment[J].Food and Agricultural Immunology，2014，25(3):350-363.

[10]LEE J K，AHN K C，PARK O S，et al.Development of an immunoassay for the residues of the herbicide bensulfuron-methyl[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(7):1791-1803.

[11]DEGELMANN P，WENGER J，NIESSNER R，et al.Development of a class-specific ELISA for sulfonylurea herbicides (sulfuron screen)[J].Environmental Science & Technology，2004，38(24):6795-6802.

[12]ZHAO J，YI G X，HE S P，et al.Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the herbicide chlorimuron-ethyl[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2006，54(14):4948-4953.

[13]陈国峰，孙悦萍，刘峰，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定环境样品中烟嘧磺隆残留量[J].农药科学与管理，2015，36(11):43-45.

Synthesis of Nicosulfuron Artificial Antigen and Preparation of Mouse Polyclonal Antibody

LI Xiao-xiao，YOU Hui-hui，GUO Qing，DU Jun-ting，DING Shu-mao，YANG Xu，YUAN Jun-lin

(HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology，CollegeofLifeScience，CentralChinaNormalUniversity，Wuhan430079，China)

Topreparethepolyclonalantibodiesagainstpesticidenicosulfuronandestablishanimmunochemicalassaytodetectnicosulfuronresidue，haptensweresynthesizedwith2-aminosulfonyl-N，N-dimethylnicotinamide(ASDM)andsuccinicanhydrideasrawmaterials.Artificialantigensweresynthesizedbyconnectingthehaptentocarrierproteinswithanactiveestermethod，andthenmicewereimmunized.ThetwoartificialantigenswerepreparedsuccessfullyandidentifiedbyUV-visiblespectroscopyandSDS-PAGE.Thecouplingratioswere10.5∶1and26.9∶1forASDMtoovalbumin(OVA)andbovineserumalbumin(BSA)，respectively.Afterquinticanimalimmunizations，theantibodytiterofallimmunizedmicewereover1∶16 000，wherebypolyclonalantibodiesagainstnicosulfuronwereacquiredfrommiceimmunizedbyASDM-BSA.AndthenanindirectcompetitiveELISAwasestablishedfornicosulfuroncontentdeterminationwithadetectionrangeof1ng·mL-1～10μg·mL-1.Thisresearchcouldprovidereferenceforfurtherdevelopmentofmoresensitive，effectiveandfeasibleELISAdetectionmethod.

nicosulfuron；artificialantigen；polyclonalantibody；ELISA

国家自然科学基金资助项目(21577045)

2016-03-24

李潇潇(1993-)，男，安徽亳州人，硕士研究生，研究方向：生物化学，E-mail：lixiaoxiao201409@sina.com；通讯作者：袁均林，副教授，E-mail:yuanjl@mail.ccnu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.09.007

TQ 450S 859.84

A

1672-5425(2016)09-0027-05

李潇潇，尤会会，郭晴，等.烟嘧磺隆人工抗原的合成与鼠源多克隆抗体的制备[J].化学与生物工程，2016，33(9)：27-31.