超高压诱变选育富锌啤酒酵母菌株的研究

2016-10-14陈情情许秀勤马艳马龙许晖李娜

中国酿造 2016年6期

关键词：致死率悬液酵母菌

陈情情，许秀勤，马艳，马龙，许晖，李娜

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233000）

超高压诱变选育富锌啤酒酵母菌株的研究

陈情情，许秀勤，马艳，马龙*，许晖，李娜

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233000）

以啤酒酵母为出发菌株，采用超高压诱变方法诱变选育高富集锌的酵母菌株。优化了超高压处理的工艺条件，并基于菌株对锌离子的耐受性和富集性，对菌株进行筛选。结果表明，培养10 h的啤酒酵母菌处于对数生长期，适宜于诱变；超高压处理压力250 MPa、保压时间20 min为诱变的最佳工艺条件；成功选育出一株高富集锌的突变菌株，其细胞锌含量达2.75 mg/g，是出发菌的6.55倍。

富锌酵母；啤酒酵母；超高压处理；诱变育种

锌是人体必需的微量元素之一，对维持机体内部蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸的正常代谢，维持细胞膜的完整性和再生，促进身体生长发育等方面起着重要作用［1］。但是只有有机态的锌元素才能够被机体安全且迅速地吸收，无机态的锌不仅被吸收的水平很低，而且毒性较大；利用微生物将无机盐形式的锌元素转化为较易被人体和动物吸收利用的有机物形式的锌是目前锌元素利用的重要手段，其中富集微量元素能力极强的酵母菌成为该领域的研究热点［2］。国内外学者对富锌酵母的营养特性、发酵培养基和发酵工艺条件作了大量研究［3-5］，同时也对生产菌株进行了一系列的诱变和筛选，包括紫外诱变、化学诱变剂诱变等方法［6-7］，以进一步提高酵母锌的产量，但存在辐射性和毒性的局限。超高压诱变技术是一种采用100 MPa以上的压力对微生物进行诱变处理的新型、安全的微生物育种方法［8］。超高压作为一种逆境胁迫，对微生物的生理功能以及核酸结构和基因表达有着较大影响，已得到学术界的广泛关注［9-10］。该技术现已广泛应用于各类酵母菌的诱变育种［11-12］，但应用在富锌酵母的育种未见报道。本研究采用超高压诱变育种法对实验室保存的啤酒酵母菌株进行选育，成功地筛选出一株富锌能力强的正突变菌株，为工业生产用菌株的选育提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种来源

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：蚌埠学院生物与食品工程系微生物实验室保存。

1.1.2培养基与溶液［13］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：葡萄糖20 g，酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 5.5。

YPD固体培养基：YPD液体培养基中加入琼脂20 g。

硫酸锌储备液：使用去离子水配制浓度0.10 mol/L的硫酸锌溶液，用浓硫酸调节pH值4.0防止沉淀物产生，115℃灭菌20 min，需要时加入已灭菌的培养基中。

1.2仪器与设备

HPP.L2-600/0.6型超高压处理设备：天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；DZ-400/2C型真空包装机：上海青葩包装机械有限公司；ZWY-100H型摇床：上海智诚仪器制造有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；TAS-990型原子吸收分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌悬液的制备

取斜面保存的啤酒酵母菌种接入装有5 mL YPD固体培养基的试管中28℃静置培养48 h进行活化。刮取3环已活化的菌种至装有50 mL YPD液体培养基的150 mL三角瓶中28℃、150 r/min摇瓶培养24 h进行扩大培养。取扩大培养后的啤酒酵母菌液10 mL于4℃、4 000 r/min离心10 min，沉淀以无菌生理盐水洗涤3次，用生理盐水调整至细胞浓度为106CFU/mL，轻微振荡30 min使菌体分散均匀，制得菌悬液。

1.3.2生长曲线的绘制

将啤酒酵母菌悬液以10%的接种量分别接入12瓶装有30 mL YPD液体培养基的250 mL三角瓶中，于28℃、150 r/min摇瓶培养，每隔2 h取出一瓶，从中吸取1 mL培养液于4℃、4 000 r/min离心10 min，以无菌生理盐水洗涤3次，加入4mL无菌生理盐水使菌体重新悬浮，以生理盐水为空白，在波长600 nm处测定吸光度值，以培养时间为横坐标，光密度OD600nm值为纵坐标绘制啤酒酵母生长曲线［14］。

1.3.3啤酒酵母菌株的耐锌能力测定

分别吸取0.10 mol/L硫酸锌溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL、100 μL到无菌平板，加入10 mL加热呈液态的斜面固体培养基，趁热摇匀，冷却即得锌离子终浓度0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1.0 mmol/L的系列平板。吸取200 μL啤酒酵母菌悬液涂布平板，于28℃倒置培养72 h，观察平板，能够长出啤酒酵母菌落的最高锌离子浓度即为啤酒酵母菌对锌离子的耐受浓度［7］。

1.3.4超高压处理压力对啤酒酵母菌株诱变的影响

将培养至对数生长期的啤酒酵母制备成细胞浓度为106CFU/mL的菌悬液，在无菌操作条件下将5 mL菌悬液转入灭菌的聚丙烯包装袋内，用真空包装机封口，设置50 MPa、100 MPa、150 MPa、200 MPa、250 MPa、300 MPa、350 MPa、400 MPa、450 MPa不同压力梯度高压处理20 min，吸取200 μL处理后的菌悬液涂布平板培养，同时以出发菌株作为空白对照。待平板上长出菌落后，根据菌落数计算致死率。

将培养至对数生长期的啤酒酵母制备成细胞浓度为106CFU/mL的菌悬液，在无菌操作条件下将5 mL菌悬液转入灭菌的聚丙烯包装袋内，用真空包装机封口，在250 MPa压力条件下分别保压处理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，吸取200 μL处理后的菌悬液涂布平板培养，同时以出发菌株作为空白对照。待平板上长出菌落后，根据菌落数计算致死率。

1.3.6突变菌株的筛选

从致死率在70%～80%的250 MPa、20 min诱变处理的平板中挑取生长快、较大的单菌落，经无菌生理盐水适当稀释后涂布于两倍耐受浓度环境平板上培养，同时以出发菌株作为空白对照。在空白对照不生长的情况下，挑取生长出的菌落接入更高浓度（如4倍和8倍耐受浓度）锌平板上驯化，并做传代培养，测定细胞含锌量，其中细胞含锌量高的菌落即为优良突变菌株。

1.3.7啤酒酵母细胞锌含量的测定

采用国家标准GB/T 5009.14—2003《食品中锌的测定》中的原子吸收光谱法。

2　结果与分析

2.1出发菌的生长曲线

通过比浊法测定啤酒酵母的生长曲线，结果见图1。

图1　啤酒酵母的生长曲线Fig.1 Growth curve ofSaccharomyces cerevisiae

由图1可知，啤酒酵母的对数生长期在8～16 h范围内，培养18 h后啤酒酵母进入稳定期。研究表明，处于对数生长期的菌体生长旺盛、代谢活性强，对诱变因素敏感［15］。因此，选择培养10 h的啤酒酵母菌液进行超高压诱变处理。

信息技术在财会工作中的应用，在一定程度上减少了财会人员的工作量，但对财务人员的要求并未降低。管理会计主要是为企业管理者在制定决策时提供有效、及时的意见或建议，如企业决策中的控制、决策、分析等工作，均需具有较高专业素质的财会工作者提供理论支持。因此，企业财会工作者必须不断提升自身专业能力，可从员工绩效管理能力、业绩评价能力、决策分析能力、财务核算能力等方面作为切入点，进一步健全自身知识体系。财务人员在提高自身专业能力同时，也应增加相关领域的知识累积，如经济分析识别、资本运营、公司治理等。

2.2出发菌的耐锌能力

观察锌离子浓度梯度系列平板上菌生长情况，能长出菌落的最高锌离子浓度即为该菌株对锌离子的最大耐受浓度。出发菌株耐锌能力测定结果见表1。

表1　啤酒酵母对锌离子的耐受能力Table 1 Zinc resistance ofSaccharomyces cerevisiae

由表1可知，在规定的培养时间内，随着平板中锌离子浓度的增加，出发菌菌落数量在不断地减少，在锌离子浓度0.8 mmol/L时菌落数最少，在锌离子浓度为0.9 mmol/L、1.0 mmol/L时没有菌落生长。因此，0.8 mmol/L为啤酒酵母出发菌对锌离子的最大耐受浓度。

2.3超高压处理压力对啤酒酵母菌株诱变影响

固定高压处理时间为20 min时，超高压处理压力对啤酒酵母致死率的影响结果见图2。

图2　压力对啤酒酵母菌致死率的影响Fig.2 Effect of processing pressure onSaccharomyces cerevisiae lethality rate

由图2可知，超高压处理可导致啤酒酵母细胞的死亡，随着压力的升高其致死率迅速增大；当处理压力达到250 MPa时，啤酒酵母细胞的致死率达到80%左右，而压力超过400 MPa时菌体几乎全部死亡。研究表明，致死率在70%～80%时微生物出现正突变较高［16］，故选取压力250 MPa作为最优处理压力。

2.4保压时间对啤酒酵母菌致死率的影响

在250 MPa压力处理条件下，不同保压时间对啤酒酵母致死率的影响结果见图3。

图3　保压时间对啤酒酵母菌致死率的影响Fig.3 Effect of processing time onSaccharomyces cerevisiae lethality rate

由图3可知，随着保压时间的延长，啤酒酵母菌的致死率也在迅速增大；当保压时间达到20 min时，细胞致死率最高可以达到80%，处理时间超过25 min，细胞的致死率变化缓慢。故从经济成本考虑，选取超高压保压时间为20 min。综上，超高压诱变处理啤酒酵母的最优诱变参数为压力250 MPa、保压时间20 min。

2.5筛选突变菌株

超高压处理后的啤酒酵母菌株经过锌浓度梯次增加的驯化培养后，在4倍耐受浓度（3.2 mmol/L）平板上生长了3株啤酒酵母，标记为UP1、UP2、UP3。将初筛出的三株菌株连续传代5代，测定细胞含锌量，并与出发菌株比较，结果见表2。

表2　啤酒酵母细胞含锌量测定结果Table 2 Determination of zinc content inSaccharomyces cerevisiae

由表2可知，啤酒酵母菌株经过超高压诱变处理后富集锌元素的能力均得到大幅度提高，其中菌株UP2提高最大，细胞锌含量达到2.75 mg/g，是出发菌的6.55倍，故菌株UP2可确定为最终获得的优良富锌酵母菌株。

3　结论

研究结果表明，超高压技术是一种可行的微生物诱变育种方法，能够显著地提高啤酒酵母富集锌元素的性能。采用压力250MPa、保压时间20min对处于对数生长期的啤酒酵母菌株进行超高压诱变处理，成功选育出一株富集锌元素能力强的突变菌株，其细胞锌含量达到2.75 mg/g，是出发菌的6.55倍，这一突变菌株遗传稳定性良好，可作为富锌酵母生产用工业菌株。超高压诱变技术操作简便、无污染，在微生物诱变育种领域具有较好的应用前景。

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CHEN Qingqing，XU Xiuqin，MA Yan，MA Long*，XU Hui，LI Na
（Department of Food and Bioengineering，Bengbu College，Bengbu 233000，China）

UsingSaccharomyces cerevisiaeas starting strain，high zinc-enrichedS.cerevisiaemutant strain was breeded by ultra-high pressure mutagenesis method.The conditions of ultra-high pressure processing were studied and then the screening was performed based on the tolerability and enrichment of mutant strains to zinc.The results showed that the strains in logarithmic growth phage after 10 h culture were suitable for the mutation，pressure value 250 MPa，pressure time 20 min were the optimal processing conditions for mutation.Finally，a strain with high enrichment of zinc（cell content 2.75 mg/g，about 6.55 times of the starting strains）was obtained.

zinc enriched yeast；Saccharomyces cerevisiae；ultra-high pressure processing；mutation breeding

TS202.3

0254-5071（2016）06-0081-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.017