光谱法研究胞外聚合物与四溴双酚A的相互作用

包宜俊,杨存满,李 颖,陆光华



光谱法研究胞外聚合物与四溴双酚A的相互作用

包宜俊,杨存满,李 颖*,陆光华

(河海大学环境学院,浅水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室,江苏 南京 210098)

利用三维荧光光谱和红外光谱研究污水处理厂活性污泥中萃取的胞外聚合物与四溴双酚A之间的相互作用.结果显示,活性污泥胞外聚合物中存在3个明显的荧光峰,分别为,x/m=230/300nm(峰A)、x/m=240/350nm(峰B)和x/m=270/370nm(峰C).荧光滴定结果表明,3个荧光峰随着四溴双酚A的加入均发生不同程度的猝灭.修正的Stern-Volmer模型和Ryan-Weber非线性模型计算胞外聚合物与四溴双酚A之间的结合常数,二者间的结合常数值(lg)在4.23~6.27之间.红外光谱和同步荧光结果显示,胞外聚合物与四溴双酚A 结合导致胞外聚合物原有的蛋白质结构发生变化.同时,考察了不同环境条件(pH值、电导率以及离子)对两者作用的影响.结果表明:pH值和离子变化对胞外聚合物与四溴双酚A结合强度有影响,但电导率的变化影响并不显著.

胞外聚合物；四溴双酚A；三维荧光光谱；结合作用

四溴双酚A(TBBA)是一种在世界范围内被广泛应用的溴代阻燃剂.它是一种类似于持久性有机污染物的潜在环境内分泌干扰物,能在环境和生物体内累积,对环境和生物产生严重的影响,如干扰生物的激素系统,影响骨骼和大脑发育等[1-3].污水处理作为TBBA进入环境前的重要消减环节尤为关键,若有大量的TBBA随出水排放进入周围环境,将对水生生物和人体健康造成潜在的危害.

活性污泥是应用最广泛的废水处理方法之一.活性污泥分泌的胞外聚合物(EPS)是微生物在生长和代谢过程中产生的一类高分子物质,主要由腐殖质、多聚糖类、蛋白类和核酸类组成[4-5].EPS覆盖在微生物细胞表面及填充在污泥絮体内部空隙中,维持着污泥的结构和功能的完整性,在活性污泥系统中起着极其重要的作用[6].由于EPS表面存在大量的活性官能团和疏水区域,因此具有极大的吸附和络合能力,能够与废水中存在的污染物结合,从而将污染物从水体中去除[7-9].Xu等[10]研究表明,EPS能够通过蛋白组分的疏水作用结合磺胺甲嘧啶,且EPS蛋白组分二级结构发生显著变化,肽链伸展导致的结构膨胀,更加有利于污染物的俘获;郑蕾等[11]研究结果表明,pH值可改变活性污泥EPS组分、浓度以及基团组成,从而改变EPS表面特性,最终导致污泥状态改变.但是他们只是研究了污染物对EPS吸附能力以及pH值对EPS本身的影响,没有考虑污染物与EPS的作用机制和水环境条件对反应体系的影响.本研究利用三维激发发射矩阵荧光(EEM)、同步荧光及傅里叶红外光谱方法研究活性污泥EPS与TBBA的相互作用机制以及不同水环境条件对两者相互作用的影响,为强化TBBA在活性污泥系统中的去除机理提供理论依据.

四溴双酚A(纯度大于99%)购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司.腐殖酸购自于Sigma公司.蒽酮试剂,酒石酸钠溶液,Fulin酚试剂,甲醇,盐酸,氢氧化钠,氯化钾,硝酸铝,硝酸钙,硝酸铁,离子交换树脂(Cation exchange resin, CER)均为分析纯,购于南京荣华科学器材有限公司.

电导率仪(雷磁,DSJ-308A,上海),高速冷冻离心机(湘智,TGL-16M,长沙),三维荧光光谱仪(Hitachi,F7000,日本),紫外可见分光光度计(Hach, Alpha-1506,美国),傅里叶红外光谱仪(Bruker, Tensor27,德国).

1.2 实验方法

1.2.1 EPS提取与测定 采自南京市江宁城市污水处理厂二沉池的活性污泥用离子交换树脂法提取活性污泥胞外聚合物.将50mL活性污泥悬浮液以5000r/min离心15min,离心后舍弃上清液,用50mL NaCl溶液(0.1mol/L)洗涤2次.将洗涤过的污泥悬浮液置于50mL的磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中.处理的污泥混合液转移至提取容器中,同时加入一定量的离子交换树脂(60g/g),在4℃下连续搅拌6h提取EPS.提取结束后将离子交换树脂/污泥的混合液静置3min,保证离子交换树脂完全沉淀.将上层提取液在4 ℃下10000r/min离心30min,得到的上清液用0.45μm醋酸纤维素膜过滤,滤液即为EPS溶液.最后将该溶液在60 ℃干燥箱中烘干得到EPS固体.EPS中多糖采用蒽酮比色法测定[12],用葡萄糖作为标准.蛋白质和腐殖酸采用改进Lowry法测定[13],分别用牛蛋白血清与腐殖酸作为标准.

1.2.2 荧光光谱实验 将从活性污泥中提取的EPS固体用磷酸缓冲溶液配制成浓度为200mg/L的储备液.移取5mL EPS溶液加入到一系列10mL比色管中,同时在每个比色管中加入不同体积TBBA溶液(1.0g/L),用磷酸缓冲液定容至10mL,得到TBBA浓度分别为2.5, 5, 7.5 , 10 , 12.5, 22.5, 25mg/L的混合溶液.为了保证EPS与TBBA充分结合,溶液振荡2h后进行三维荧光以及同步荧光测定.设置对照实验和平行实验,测试结果取平均值.三维荧光光谱激发波长和发射波长范围均为200~500nm;激发和发射狭缝设为2.5nm;扫描速度为12000nm/min.同步荧光光谱采集采用同步扫描波长从270~400nm;激发和发射间隔波长60nm;扫描速度为12000nm/min.

1.2.3 红外光谱实验 采用红外光谱方法对EPS与TBBA结合前后构型变化进行分析.在配有DTGS KBr检测器和衰减全反射(ATR)附件的FT-IR光谱仪进行红外光谱测定,所测样品与上述三维荧光光谱分析所用溶液相同.利用ATR方法记录所有光谱,在分辨率4.0cm-1条件下扫描6次收集红外光谱.仪器自带软件采集数据, Origin8.0对数据进行分析.

1.2.4 环境条件实验 移取5mL EPS储备液到一系列10mL比色管中,同时在每个比色管中加入250μL TBBA溶液(1.0g/L),用磷酸缓冲液定容至10mL,得到待测溶液.使用1.0mol/L盐酸和1.0mol/L氢氧化钠溶液调节待测溶液pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,进行pH值条件的实验.使用3.0mol/L KCl溶液调节待测溶液电导率分别为1800, 2000,2200,2400,2600, 2800,3000μS/cm,进行电导率条件的实验.在待测溶液中分别加入50μL 0.01mol/L的Ca2+、Al3+、Fe3+离子进行不同离子条件的实验.将上述混合溶液振荡2h后进行三维荧光测定.设置对照实验和平行实验,测试结果取平均值.

1.3 数学模型分析

使用Stern-Volme方程[14]、修正的Stern- Volme方程[15]和Ryan-Weber非线性模型[16]分析EPS与TBBA的荧光猝灭机制,并计算其作用强度(即结合常数).

-Volme方程如下:

式中:0和分别为TBBA加入前后EPS所测得的荧光强度;SV为猝灭常数;q为生物分子猝灭速率常数;为分子的荧光寿命,通常对于生物大分子值为1.0×10-8s;为加入TBBA浓度.

修正的Stern-Volmer方程如下:

式中:是滴定前后荧光的变化值占初始荧光强度的比例;为结合常数.

Ryan-Weber非线性模型如下:

式中:假设未加入TBBA时EPS的荧光强度为100.是EPS与对应浓度TBBA结合后的荧光强度相对初始荧光强度的百分值;end为滴定达到理论终点时的荧光强度相对初始荧光强度的百分值.为结合常数;为加入TBBA浓度;c为EPS中配体的总浓度.

2 结果与讨论

2.1 EPS的荧光特性研究

从图1可以看出,活性污泥EPS有3个荧光吸收峰,分别为峰A(x/m=230/300nm)、峰B(x/m=240/350nm)和峰C(x/m=270/370nm).峰A位于I区(含芳环基团的类蛋白物质I),峰B位于II区(含芳环基团的蛋白质II区).峰C位于Ⅳ区(溶解性微生物副产物)[17-18].峰A、峰B和峰C都属于类蛋白峰,与EPS中的芳环氨基酸结构有关[19-20].随着TBBA浓度的增加,EPS峰A和峰B的荧光强度不断降低.但峰C的荧光强度降低并不明显,这主要是由于峰C为溶解性的微生物副产物,而TBBA与EPS的结合主要发生在类蛋白质上的基团.EPS荧光峰的变化表明活性污泥EPS和TBBA发生了相互作用,导致EPS本身结构发生了变化.

2.2 EPS与TBBA作用机制研究

从图2可以看出,随着TBBA浓度的逐渐增大,3个荧光峰的值也逐渐增大,和TBBA浓度之间呈线性关系.峰A、峰B和峰C的猝灭速率常数q值是生物大分子与猝灭剂相互作用最大q值(2.0×1010L/(mol·s))的100~1980倍,说明TBBA对EPS的荧光猝灭不是由动态碰撞引起的,而是属于静态猝灭过程,即TBBA与EPS中的荧光基团生成不发荧光的络合物.

表1表明:EPS与TBBA有较大的结合常数,并生成稳定的EPS-TBBA络合物.其中类酪氨酸(峰A)的结合强度要大于其它2类蛋白峰,与苯、菲等有机污染物的结合常数相近[13].说明活性污泥中的EPS能够对污水生物处理过程中TBBA的迁移和归趋产生影响.

2.3 TBBA对EPS结构变化影响

红外光谱可以作为定性工具监测污水处理厂活性污泥EPS化学基团,提供EPS 结构变化相关信息.图3红外光谱显示,EPS结构中存在蛋白和多糖吸收峰,较弱的羧酸类和酚类吸收峰.3800~3000cm-1为EPS中蛋白和多糖的羟基伸缩振动[21-23],2360cm-1左右为NH的伸缩振动.1670,1540cm-1的强烈吸收为蛋白中酰胺I(主要是C=O伸缩振动)和酰胺II(C—N伸缩振动和—N—H变形振动)[21].与EPS相比,加入TBBA后EPS红外谱图发生了微弱的变化,EPS酰胺I峰从1670cm-1移至1645cm-1,TBBA与EPS中的C=O和C—N或—N—H基团结合,导致EPS的结构发生变化.

在利用红外光谱研究EPS与TBBA结合前后的结构变化的同时,同步荧光光谱也被用于EPS结构变化的研究.通过测定EPS与TBBA作用后最大发射波长的变化,研究EPS的结构变化.由于EPS主要是由类蛋白质组成,当Δ为60nm时,同步荧光可以得到色氨酸残基的特性.从图4可以看出,随着TBBA浓度增加,EPS同步荧光光谱强度有规律的减弱,同时在290nm处的同步荧光峰发生红移.由于TBBA进入EPS蛋白中色氨酸残基的疏水区域,导致肽链伸展,从而使色氨酸暴露在水溶液中.色氨酸残基处于相对亲水的微环境中,使得同步荧光峰发生红移[24],表明TBBA与EPS官能团之间结合,改变了EPS蛋白质自身的结构.通过红外光谱以及同步荧光光谱的研究,可以得知污水处理厂活性污泥产生的EPS中的蛋白质能与TBBA结合,从而降低其在污水中的浓度.

2.4 离子对EPS-TBBA体系结合强度的影响

由于污水中会同时存在多种物质,可能和TBBA发生竞争作用,降低EPS与TBBA的结合强度.选取城市污水中检出率较高的3种金属离子Ca2+、Al3+、Fe3+,研究其对EPS-TBBA体系结合强度的影响.从表2中可知,Ca2+的存在使EPS-TBBA体系的结合增强,说明Ca2+的存在能够促进EPS与TBBA的结合.而Al3+的存在则导致结合常数的减低,说明Al3+能够和TBBA产生竞争作用,降低EPS与TBBA的结合.2种模型计算Fe3+的存在下对EPS-TBBA体系的结合强度的变化稍有差异性,修正的Stern-Volmer模型显示Fe3+的存在一定程度上增强了体系的结合.

表2 不同离子对EPS-TBBA体系结合常数影响Table 2 Binding constant (lgK) of EPS-TBBA system at different ions

2.5 离子强度对EPS-TBBA体系结合强度的影响

从图5可以看出,在不同电导率情况下,体系的荧光强度并没有明显变化.计算不同电导率条件下EPS-TBBA体系的结合常数,并采用SPSS软件对实验数据进行统计分析,客观地反映离子强度对结合常数的影响程度,皮尔逊系数(p)是一个介于-1.0到1.0之间的无量纲指数,反映了2个参数之间的相关性方向与强度,其中-1.0表示完美负相关,1.0表示完美正相关,0表示无相关性.统计结果见表3,2种模型下的p值均小于0.75,且值均大于0.05,即电导率的变化对体系结合强度没有显著影响(表3).说明离子强度的变化对体系的结合强度影响相对较小.

表3 电导率与EPS-TBBA体系结合常数线性相关的统计结果Table 3 Statistical results of linear correlations between conductivity and binding constant

2.6 pH值对EPS-TBBA体系结合强度的影响

不同pH值条件下EPS以及EPS-TBBA体系荧光强度如图6所示.从图6可以看出猝灭作用的影响,当pH值在3.0~6.0时,EPS荧光强度显著增强;当pH值在6.0~9.0时,EPS荧光强度趋于稳定.EPS-TBBA体系荧光强度随pH值的增加逐渐降低,且在pH=8.0时达到最小.表4为不同pH值条件下EPS与TBBA结合强度值.由表4可知,不同pH值条件下2种模型拟合得到的结果与之前得到的结合常数值相比均有变化,相关性分析结果显示(表5),2种模型下的p值均小于0.75,且值均大于0.05.说明pH值与结合强度值没有显著相关性,但pH值的变化一定程度上也影响了EPS与TBBA的结合强度.在污水处理过程中,水体的酸碱度会影响到活性污泥分泌出的EPS与TBBA的结合,影响TBBA的去除率.pH值对EPS-TBBA结合的影响主要是由于pH值的变化会改变TBBA在水体中的离子状态,以及EPS的表面带电性和分子的构象,从而导致相互作用的变化[25].

表4 不同pH值对EPS-TBBA体系结合常数的影响Table 4 Binding constant (lgK) of EPS-TBBA system at different pH

3 结论

3.1 EPS中荧光峰能被TBBA明显猝灭,修正的Stern-Volmer方程和Ryan-Weber非线性模型拟合得到的结合常数表明,EPS与TBBA间存在较强的结合作用,说明TBBA能够被活性污泥分泌的EPS有效的富集.

3.2 红外光谱和同步荧光光谱分析结果表明,EPS与TBBA结合后,EPS中含有的蛋白质原有结构由于和TBBA作用发生了改变.

3.3 pH值与结合强度值没有显著相关性,但pH值的变化一定程度上也影响了EPS与TBBA的结合强度.3种金属离子对体系的影响各不相同,Ca2+使EPS-TBBA体系的结合增强,Al3+的存在则导致结合常数的减低,而Fe3+能够显著影响体系的结合强度.电导率条件的p值均小于0.75,且值均大于0.05,即离子强度的变化对体系结合强度没有显著影响.

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* 责任作者, 副教授, hj6688@hhu.edu.cn

Spectroscopic methods study of the interaction of extracellular polymeric substance and tetrabromobisphenol A

BAO Yi-jun, YANG Cun-man, LI Ying*, LU Guang-hua

(Key Laboratory of Integrated Regulation and Resource Development on Shallow Lakes, Ministry of Education, College of Environment, HoHai University, Nanjing 210098, China)., 2016,36(6)：1773~1779

Three-dimensional fluorescence spectroscopy and infrared spectroscopy were used to investigatethe interaction between tetrabromobisphenol A (TBBA) and extracellular polymeric(EPS) from sludge. There were three particular fluorescence peaks in spectra of EPS,x/m=230/300nm (peak A),x/m=240/350nm (peak B) andx/m=270/370nm (peak C), respectively. The results of fluorescence titration revealed that the three fluorescence peaks of EPS could be quenched by TBBA. The binging constants (lg) were calculated by the modified Stern-Volmer model and the Ryan-Weber model, ranged from 4.23 to 6.27. Infrared spectroscopy and synchronous fluorescence spectroscopy indicated the combination of EPS with TBBA has led to a change in EPS structure. The effect of environmental condition (i.e. pH, ions, and conductivity) on TBBA binding with EPS were evaluated. The results show that pH and ions affected binding affinity, but the effect ofconductivitywas minor.

EPS；TBBA；three-dimensional fluorescence spectrum；binding

X131.2

A

1000-6923(2016)06-1773-07

包宜俊(1991-),男,江苏镇江人,河海大学硕士研究生,主要从事环境污染化学研究.发表论文1篇.

2015-11-06

国家自然科学基金资助项目(51209068,51479067);江苏高校优势学科建设工程资助项目