血清中有机磷农药乐果含量的GC-NPD测定法的研究

张鹏鹏，王中亮，芦　玉，崔亚东，杨京霞，2*

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院；2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳，236037）

血清中有机磷农药乐果含量的GC-NPD测定法的研究

张鹏鹏1，王中亮1，芦玉1，崔亚东1，杨京霞1，2*

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院；2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳，236037）

目前文献记载乐果的检测多为蔬菜和水果的残留量，对中毒病人血液中乐果的检测较少，本研究采用气相色谱法建立一种快速而又准确的检测病人血样中农药乐果含量的分析方法。以丙酮为萃提溶剂，氮磷检测器（NPD），HP-5毛细管柱，采用程序升温的方法，在4.51 min出现乐果色谱峰且峰形较好，在浓度为0.65～10.00 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数r值为0.993 4，乐果检出下限为0.03 μg/mL，回收范围是90.12%～95.34%，RSD值均小于5%。该方法分析时间短、准确度高，具有较高的临床应用价值。

血清；乐果；氮磷检测器；气相色谱法。

有机磷农药（Organophosphorus Pesticides）是近年来我国使用量最大的一类农药，具有药效高、易降解、种类多、用途广等优点，在农业生产中使用最为广泛［1-2］。乐果是常见的有机磷农药，用于防治多种作物上的刺吸式害虫如蚜虫、叶蝉、粉虱等。但乐果较易挥发，并通过食物链的富集作用转移到人体。陈建秋等［3］的研究表明乐果具有一定的生殖毒性，具有潜在的致畸、致突变和致癌作用［4］。乐果口服中毒后能够影响全身脏器，并能引起中枢神经系统样症状，不仅对呼吸中枢产生抑制作用，而且还具有较强的外周呼吸肌麻痹作用［5-6］，故其导致呼吸衰竭的发生率明显高于其他种类农药，严重的可引起呼吸衰竭而死［7］。乐果中毒的潜伏期较长，误服后0.5～2小时出现中毒症状，死亡多在3～30小时发生［8］。我国是农药生产和使用大国，特别在农村由于自我保护意识较差而出现轻度中毒，还有些因家庭纠纷出现服毒自杀情况。鉴于乐果的毒性强，使用广，致死率高等特点，临床急救需一种能够快速、准确检测中毒病人血液中乐果浓度的方法，以便更好的对病人进行监控和治疗。

根据文献报道，乐果检测常用的方法有气相色谱-质谱联用（GC-MS）［9］、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）［10］、液相色谱法（HPLC）［11］和气相色谱法（GC）。气相色谱法在乐果的测定中应用较多，多数国家标准都采用气相色谱法。乐果属于中极性农药，一般采用非极性、弱极性等毛细管柱［12-13］。乐果中含有磷元素，多采用氮磷检测器（NPD）和火焰光度检测器（FPD）［14-15］。目前关于乐果的检测多集中在水果、蔬菜等农副产品的表面残留上，对于血液这种复杂的载体，文献报道较少。本文采用气相色谱法对病人血液中乐果的浓度进行检测，具有一定的临床应用价值和创新性。

1　材料与方法

1.1试剂

健康人血液；乐果标准液（100 μg/mL，北京中科仪友化工技术研究院）；丙酮（分析纯，西陇化工股份有限公司）；超纯水等。

1.2仪器

气相色谱仪（安捷伦7890-A，配NPD）；超纯水系统（Milli-Q）；氮气发生器（UNPN2-1500C-E）；离心机（MiniSpin）等。

1.3实验方法

1.3.1乐果标准储备液的制备

精密量取500 μL的乐果标准液至1.5 mL EP管中，再精密量取丙酮500 μL定容至1 mL，混匀即可得50 μg/mL乐果标准储备溶液。

1.3.2中毒样品的制备

取健康人血液放置4℃冰箱，1小时后10 000 r/min离心3分钟，分离血清。取血清0.5 mL于EP管中，准确移取100 μg/mL乐果标准溶液0.03 mL、0.09 mL、0.15 mL于上述EP管中，在振荡混匀器上振荡混匀，然后加丙酮1 mL，振荡2 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液，残渣再用丙酮萃提一次，离心后取上清，合并两次离心所得的上清液，用丙酮溶液定容至3.0 mL，即制备成低浓度（1.0 μg/mL）、中浓度（3.0 μg/mL）、高浓度（5.0 μg/mL）乐果中毒样品。

1.3.3气相色谱条件

检测器：NPD，温度300℃；色谱柱：HP-5毛细管柱（30 m*0.320 mm*0.25 μm）；色谱柱程序升温条件：120℃保持1 min，然后以20℃/min升至270℃，保持2 min；流速7 mL/min；进样口温度：220℃；进样量：2 μL；进样方式：无分流进样。色谱图见图1-3。

2　实验结果

2.1线性测定

取50 μg/mL的乐果储备液逐级稀释成10 μg/ mL、7.5 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.65 μg/mL的乐果溶液，分别进样分析，每个样品测定三次。由样品的峰面积和对应浓度所计算的样品质量的散点图呈直线趋势，作线性回归分析，得回归方程为Y=213.6X+368.6，r=0.9934，结果表明乐果在浓度0.65 μg/mL～10.00 μg/mL范围内，线性关系较好。

2.2重复性实验

取病人甲血样5份，按上述样品制备方法进行处理，测得病人血样中乐果的浓度为0.36 μg/ mL，峰面积的RSD值为4.33%，实验表明该方法的重复性较好。

2.3最低检测限实验

将50 μg/mL的乐果标准储备液，逐级稀释成1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、0.025 μg/mL，备用，根据检测限计算方法3C/（S/N），即当测量峰高是噪音峰高的3倍时，此时浓度为检测限浓度，本实验中测得乐果的最低检测限浓度为0.03 μg/mL。

2.4稳定性实验

将病人血样按上述样品制备方法处理后，于室温放置2 h、4 h、5 h、7 h、8 h、10 h后分别进样分析，测得乐果峰面积的RSD值为2.98%，结果表明乐果在室温条件下10 h内比较稳定。

图1　丙酮溶液色谱峰（100 μg/mL）

图2　乐果标准溶液色谱峰（5.0 μg/mL）

图3　病人血液色谱峰（0.12 μg/mL）

2.5回收率实验

精密量取已知乐果浓度的病人血样9份，每份100 μL，分别加入一定量的乐果标准液，制成含

乐果浓度为80%、100%、120%μg/mL的样品溶液各3份，进样分析，

结果如表1。

表1 乐果回收率结果

2.6样品的测定

取病人乙血样按照样品制备方法处理后进样分析，经外标法计算得病人血样中乐果的浓度为0.12 μg/mL。

3　结论与讨论

3.1色谱条件的研究

在气相色谱条件探究过程中，本实验对于柱温进行了一系列研究。方法一：色谱柱120℃保持2 min，然后以5℃/min升至240℃，保持2 min，再以25℃/min升温至270℃，保持2 min；方法二：色谱柱80℃保持2 min，然后以10℃/min升至270℃，保持3 min；方法三：120℃保持1 min，然后以20℃/min升至270℃，保持2 min。方法一虽然有乐果峰出现，但是多次测量结果RSD≥5%，而且整个图谱中杂峰较多，干扰乐果峰的分离。方法二乐果峰出现较好，基本无拖尾现象，且出峰时间附近无杂峰干扰，但是样品分析时间达20 min以上，不能达到快速高效的目的。因此将这两种方法进行优化，确定方法三，乐果出峰时间在4.51 min附近，且峰型良好，该方法分析过程短，精密度高，可为临床治疗提供一定的依据。

3.2样品制备方法的研究

在样品制备过程中，先后采用氯仿、高氯酸和丙酮进行处理，高氯酸和氯仿与乐果不能有效分离且乐果峰拖尾严重，以丙酮做为萃提溶剂，丙酮与乐果出峰时间间隔较长（如图1图2所示），可以完全分离没有干扰，乐果峰峰形尖锐且较为对称，最后确定丙酮为萃提试剂。

现有文献记载乐果的检测多为蔬菜和水果，对中毒病人血液中的检测较少，该方法扩大了乐果的检测范围，可以很好的分离血液中的蛋白质，并能准确较快的检测出血清中乐果的浓度，具有较高的临床应用价值和创新性。

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GC-NPD testing content of Dimethoate in Organophosphorus pesticide in serum

ZHANG Peng-peng1，WANG Zhong-liang1，LU yu1，CUI Ya-dong1，YANG Jing-xia1，2*

（1.School of biological and food engineering，Fuyang Normal University；2.Engineering Technology Research Center of Antiaging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province，Fuyang Anhui 236037，China）

A rapid and accurate detection of content of dimethoate in patients'blood samples was established by the gas chromatography.With acetone as extraction solven，using nitrogen and phosphorus detector（NPD）as well as chromatographic column for HP-5 capillary column，，the experimental results showed that dimethoate peak time is 4.51 min by temperature-programmed method.In the range of 0.65 μg/mL to 10 μg/mL，the linear relationship is good，and the correlation coefficient r value is 0.993 4，and the detection limit of dimethoate is 0.03 μg/mL，and the recovery range is 90.12%～90.12%，while RSD values are less than 5%.The current literatures for the detection of dimethoate residues are mainly for fruits and vegetables，while the detection of dimethoate in the blood of poisoning patients is less.This testing method is fast and accurate，with high clinical application significance and innovation.

serum；organophosphorus pesticide；nitrogen and phosphorus detector；gas chromatography

R979.9

A

1004-4329（2016）02-046-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2016）02-046-04

2015-07-14

阜阳师范学院省级平台委托专项（2014KSLZX02）；安徽省大学生创新创业训练计划项目（AH20141037108 9，AH201510371066）资助。

杨京霞（1982－），女，硕士，讲师，研究方向：中草药成分及活性研究。Email：yangjingxia1228@126.com。