新疆家蚕抗菌肽研究现状及应用综述

修妤　娄齐年　王安皆　石瑞常　华丽峰

【摘 要】抗菌肽是生物机体进行自我防御的屏障，能够抑制杀死多种细菌及寄生虫，但不同生物体内的抗菌肽在结构特征上存在较大差异，本文主要介绍了家蚕抗菌肽的特性，并重点介绍了新疆家蚕抗菌肽的研究现状和应用前景。

【关键词】新疆家蚕；抗菌肽；特征；应用

高等生物的免疫防御体系来其自身免受细菌的侵害的重要屏障。虽然昆虫没有高度特异性的免疫体系， 但可以通过产生具有强活力的抗菌肽应对受到外界微生物刺激。抗菌肽作为低等动物机体快速有效的免疫屏障，是自然界中普遍存在的具有免疫效应的阳离子活性多肽，在机体的先天非特异性免疫中起重要作用[1-3]。第一个真正意义上的抗菌是于1972年由瑞典科学家boman等从惜古比天蚕（Hyatophora-cecropia）蛹中诱导分离出来的。boman等并将其命名为天蚕素（Cecropin）[4]。随后在细菌、植物、昆虫、鱼类、两栖类和哺乳动物中也发现了种类繁多的抗菌肽[5]。

抗菌肽并不同于代谢过程酶促反应生成的多肽类抗生素，它是由基因编码、蛋白质翻译系统合成的具有抗菌活性的一类小分子多肽的总称[6]。目前，己经通过研究分离获得多种抗菌肽，并测定了其基因序列和氨基酸序列。大多数抗菌肽分子有两性的α-螺旋结构域，并富含碱性氨基酸，表现出抗菌肽的主要特征[7]。

自二十世纪中叶以后，抗菌肽的研究一直是生命科学研究的热点之一。研究表明，抗菌肽具有分子量小，热稳性较高，抗菌谱广，并且不具有抗原性和不会产生耐药性，同时还表现出广谱的抗菌性，尤其是在目前抗生素的耐药性日益严峻的情况下，抗菌肽的应用价值倍受关注，有望成为抗生素的最佳替代者，因而吸引了医学界和生物学界的广泛关注。

新疆生物资源种类繁多、品种独特、特性优良，开发和发展的潜力较大。但新疆生物资源研究领域还有许多空白点，资源的利用率较低。 近几年对新疆家蚕的研究和开发利用已经成为焦点，本文就新疆家蚕抗菌肽的研究现状及应用做以下综合阐述。

1 抗菌肽的理化性质

抗菌肽是生物机体产生一种小分子多肽，天然抗菌肽含氨基酸数目不等，碱性，水溶性好。大部分抗菌肽具有热稳定性，在100℃时加热10～15min仍然可以保持活性。新疆家蚕的抗菌肽在加热煮沸8h时，仍能保持良好活性[8]。带有一个净正电荷，两亲性，富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸 ，亲水端则富含丙氨酸和甘氨酸等非极性氨基酸，并往往发生酞胺化，是新疆家蚕抗菌肽的主要特征。目前，已从单细胞生物、昆虫和其它无脊椎动物、植物、两栖类动物、鸟类、鱼类和哺乳动物，包括人类中分离到抗菌肽。此外部分抗菌肽还具备抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力[9]。

抗菌肽具有广谱抗菌，单一的抗菌肽即可抑制杀死多种细菌、真菌和某些寄生虫，并对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用。另外，在加速免疫和伤口愈合方面抗菌肽同样有显著作用。虽然抗菌肽的作用对象种类繁多，但其发挥作用的位点是相同的，即膜成分。抗菌肽发挥防御作用的基础在于细胞膜结构的特点，这些特点是动植物所不具备的，这方面的研究使人们对抗菌肽的认识更深入。

2 抗菌肽的分类

目前研究抗菌肽结构的主要方法有圆二性色谱和二维核磁共振等。按照抗菌肽的结构特征主要将其划分为4类：即α-螺旋、β-折叠、环形、伸展性结构[10]等。

2.1 α-螺旋型抗菌肽

α-螺旋型抗菌肽主要特征为分子内具有一个或多个螺旋结构域，通常含有小的弯曲结构域，如cecropin，magainin。以cecropin A为例，其N端和C端均为α-螺旋，形成两性α-螺旋结构。其中N端的1～21个氨基酸构成一段带正电的亲水螺旋，C端发生酞氨化，第25～37个氨基酸构成一段带负电的疏水螺旋结构域，两段α螺旋由1个短链的AGP（丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸）连接。目前已经发现的20多种cecropin抗菌肽均具有较高的相似性。

α-螺旋抗菌肽分子通过其两性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电荷的静电吸引而结合，紧接着抗菌肽分子的疏水端借助于分子中AGP连接插入到质膜中，然后抗菌肽分子两性α-螺旋也插入到质膜中，通过破坏脂质双分子层原有的有序结构，使抗菌肽分子通过膜内分子间的位移相互聚集在一起，从而在膜上形成离子通道，细菌最终因不能保持正常渗透压而死亡[11]。

2.2 β-折叠型抗菌肽

β-折叠型抗菌肽分子内存在β-折叠和反平行的β-折叠结构，分子内含有稳定结构的二硫键，有助于抗菌肽穿过细胞膜。在分离自日本鲎（Tachypleus tridentatus）血细胞的酸性抽提物TachyplesinI（TPI）中， Tachyplesins与LPS之间具有较强的结合力，能引起磷脂分子在细胞膜中的翻转及侧移等。说明此类抗菌肽能破坏磷脂分子的有序排列，在不形成稳定性孔洞或通道的前提下，使多肽分子穿过脂双层[12]。

2.3 环状结构型的抗菌肽

环形肽具有高度可变性结构，thanatin即属此类。除了β-折叠结构， 环形肽也能够形成具有两性性的α-螺旋结构，肽分子中含有的半肽氨酸，能够形成分子内二硫键。如防御素（defensins）可通过二硫键连接形成环状结构。具有两性α-螺旋结构域的环形肽，抗菌作用机理与α-螺旋型抗菌肽基本相同，都是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而最终导致细菌死亡。不同之处是由于防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成膜穿孔，但其分子结构和电生理研究提示，防御素分子能以多聚体的形式作用于细胞膜[13]。

2.4 伸展性结构型的抗菌肽

这类抗菌肽通常缺少典型的二级结构，多呈线型，富含脯氨酸、甘氨酸等小分子氨基酸，其抗菌活性结构是通过肽与质膜间的氢键或范德华力形成，但一般不依赖于残基间的氢键。这一类抗菌肽这结构组成上主要表现为：富含脯氨酸的抗菌肽，如Indolicidin ；富含甘氨酸的抗菌肽，如Hemiptericin和Coleopterlcin。富含脯氨酸的抗菌肽抗菌机制比较特殊，它们能够穿过细胞膜进入细胞质，锚定于细菌生长所必需的靶因子，并抑制其生物学功能，从而导致细菌死亡。富含甘氨酸的抗菌肽，如Attacins，其作用模式可能是干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白基因OpmC，OpmF和OpmA的转录，使这些细胞外膜的结构性蛋白表达降低，从而导致膜的通透性增加，细菌的生长受到抑制。

3 新疆家蚕抗菌肽特性及抗菌作用的超微结构观察

新疆家蚕抗菌肽的杀菌活力为：1 μg/μl，抗菌肽与24 000U 的氨苄青霉素杀菌活力相当；抗菌肽具有很强的热稳定性；在含有氨苄青霉素的金黄色葡萄球菌的固体培养基上， 加入抗菌肽的孔周围有明显的抑菌圈，表明新疆家蚕抗菌肽可以杀灭抗氨苄青霉素的环境微生物。抗菌肽能够耐受一定范围酸碱的影响；高浓度盐不影响抗菌肽抗菌活性；用琼脂孔扩散实验检测抗菌肽对不同细菌抗菌活性发现，抗菌肽对大肠杆菌、化脓杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、谷氨酸杆菌、变形杆菌等有不同程度的杀灭抑制作用， 其中抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强， 对巨大芽孢杆菌、谷氨酸杆菌、苏云金杆菌、变形杆菌的抗菌作用次之， 对大肠杆菌和化脓杆菌的抑菌作用稍弱一些，相当于抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌作用的一半。

迄今为止， 已分离获得700 多种抗菌肽，关于抗菌肽的抗菌机理看法不一，目前抗菌肽对细胞膜磷脂分子层的渗透主要有两种模式：“桶-板”模型（barrel-stave pore）和“毯式”模型（carpet model）， 不同类型的抗菌肽可能采用不同模式的作用机制[14]。

刘忠渊等采用透射电镜研究了新疆家蚕抗菌肽对金黄色葡萄球菌的作用过程。结果发现，在利用抗菌肽处理金黄色葡萄球菌时， 发现细菌细胞表面部分区域变模糊、粗糙， 并且随着时间的延长模糊、粗糙的区域性增大， 表明抗菌肽的作用可能使金黄色葡萄球菌内容物泄漏，导致细菌死亡， 且作用效果与时间呈正相关。金黄色葡萄球菌细胞膜在经过长时间的抗菌肽处理后呈中空圆环， 但是细胞壁完整，提示抗菌肽主要是作用靶位在细胞膜上，通过溶解使内容物泄漏，导致细菌死亡。王云起等研究发现抗菌肽magainin Ⅱ 以“ 毯式” 作用方式破坏大肠杆菌的外壁， 抗菌肽分子环绕着菌体切断胞膜， 使大肠杆菌细胞从中断裂成两节[15] 。如果新疆家蚕抗菌肽采用的是“毯式” 的作用模型杀菌，金黄色葡萄球菌细胞应该可以观察到断裂、残缺的胞体， 而在透射电镜下却未观察到此类细胞结构，因而推测新疆家蚕抗菌肽很可能是通过“桶-板” 模式渗透细胞膜，首先是抗菌肽分子多聚体化，然后插入细胞膜形成孔洞， 进而使细胞内容物从孔道向胞外渗漏，通过影响细菌的新陈代谢系统起到抑菌杀菌作用。目前关于抗菌肽的膜定位方式有待于进一步的研究。

4 抗菌肽表达及优化

抗菌肽Cecropin XJ通过提取新疆家蚕总RNA 并进行RT-PCR， 获得抗菌肽cDNA 分子， 通过与GenBank 中已发表抗菌肽序列进行比对分析， 确定新的抗菌肽基因。将Cecropin-XJ亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA 上， 通过转化酵母表达产物。通过对浓度（330mg∕mL）和其分子量（理论值7kD）分析发现 ， 酵母表达系统所表达的产物为17.5kD ，说明该分子很可能在水溶液中以二聚体的形式存在[8]。为了提高 Cecropin XJ 融合蛋白的产量，康苏等通过调整培养基的碳氮比、诱导时间和诱导剂浓度对蛋白进行优化提高蛋白的表达量，但是该研究并没有对诱导温度进行优化，原因在于37℃未必是蛋白表达的最适温度却是细菌生长的最佳温度。这些条件的确定为我们后期要进行的重组蛋白的规模化生产奠定基础。

5 新疆家蚕抗菌肽的应用

5.1 新疆家蚕抗菌肽对鲜榨果汁防腐效果的影响

新疆家蚕抗菌肽（Cecropin XJ）基因是从阿克苏新蚕 3 号蚕体中通过克隆获得，并已在原核和真核系统中成功表达。Cecropin XJ 属于天蚕素B 类家族，具两亲性α-螺旋区域，信号肽含26个氨基酸，前体肽含37个氨基酸，具有较强的热和酸稳定性，单一使用时抗菌谱广，在食品工业中具有潜在的应用价值。

不同浓度的新疆家蚕抗菌肽（Cecropin XJ）可以作为防腐剂添加到鲜榨番茄汁和葡萄汁中，并能有效抑制鲜榨果汁中病原微生物的生长，对鲜榨番茄汁和葡萄汁起防腐作用。实验结果表明 0.02%（w/v） Cecropin XJ 与相同浓度的山梨酸钾防腐效果没有统计学差异，能够显著延长鲜榨番茄汁和葡萄汁保鲜期，表明 Cecropin XJ 在食品防腐产业应用中具有潜在的商业价值[16，17]。

5.2 新疆家蚕抗菌肽抑制掌面革兰氏阴性菌的研究

抗菌肽也广泛应用于食品工业，目前主要的应用抗菌肽有细菌素 Bacteriocin AS-48、Nisn 和乳源抗菌肽等。根据对Cecropin XJ 的广谱抑菌作用的研究，设计并对手掌表面菌的抑制消毒进行了初步探索，结果表明 Cecropin XJ 对手掌擦拭液中的微生物有明显抑制作用。

5.3 新疆家蚕抗菌肽在番茄汁加工中的应用研究

抗菌肽具有强大的抗菌活性，但它不是细胞毒素，可以被人体内的酶系降解、消化，且多数具有酸、热稳定性和低温贮藏稳定性，是一类潜力很大的生物防腐剂。由于抗菌肽具有众多优点，迅速成为生命科学领域的研究热点，对昆虫抗菌肽的研究具有重要理论意义和实际应用价值。由于其来源安全可靠，无毒副作用并可在一定食品范围内起到抑制微生物的生长繁殖，防止食品腐败变质，具有降低相应食品的杀菌强度的作；且有实验表明：抗菌肽无致畸变作用，无蓄积毒性，不容易产生抗药性[18]，因而寻找和开发应用新的抗菌肽工作越来越受到重视。郑力等以茄汁为载体对新疆家蚕抗菌肽在食品工业中的应用进行研究。分析认为：抗菌肽可用于番茄汁的UHT（一般为135～150℃、1～3min）工艺，虽无法缩短杀菌时间，但在相同杀菌时间条件下可降低杀菌温度，在工业化生产中大大降低生产动力成本，因而抗菌肽的工业化应用前景广阔。

6 抗菌肽的应用前景

目前在防治引起高等动物的各种细菌性、病毒性疾病及其它病害时， 由于抗生素的滥用， 使某些病原体产生了耐药性， 而导致无法有效地防治病害的发生，并且新的抗生素的筛选也极为困难， 特别是真菌病害在当前仍是一个难以解决的问题。抗菌肽在昆虫中的发现， 尤其是抗菌肽对耐药性致病菌的有良好杀灭作用和在致畸变作用、蓄积毒性、抗药性产生等方面的明显弱化特点， 无疑为治疗这几类病害提供了新的途径。抗菌肽活性强， 功能广泛， 在应用研究中的潜在重要价值，引起了越来越多研究者的重视。在肿瘤及癌症治疗方面， 大部分化疗药物往往会同时抑杀癌细胞和正常细胞， 引发较大的毒副作用，而抗菌肽能选择性地抑制某些肿瘤细胞的生长， 对正常细胞无副作用， 这是肿瘤化疗药物所不具备的。因此， 抗菌肽在医药中有广阔的应用前景， 有望成为抗菌素、抗病毒素、抗癌药物的新替代者。

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[责任编辑：朱丽娜]