PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响

白雪，冯浩，张柳，杨志博，宁宏

（中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001）

·论著·

PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响

白雪，冯浩，张柳，杨志博，宁宏

（中国医科大学附属第一医院眼科，沈阳 110001）

目的探讨PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响。方法采用不同浓度PP242处理培养传代的永生系人晶状体上皮细胞系SRA01/04。采用MTT法检测处理24、48 h后的细胞生长抑制率，采用实时定量RT-PCR和免疫印迹法检测不同浓度PP242处理48 h后Bcl-2mRNA和蛋白表达水平的变化情况。结果100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞SRA01/04作用24、48 h后，细胞生长抑制率24 h组分别为7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%，48 h组分别为11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%，与对照组（0 nmol/L）比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。免疫印迹法检测结果显示：在相同作用时间内，随着PP242药物浓度的增加，Bcl-2蛋白的表达水平逐步下降，与对照组（0 nmol/L）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。实时定量RT-PCR检测结果显示：在相同作用时间内，随着PP242药物浓度的增加，Bcl-2mRNA表达水平亦逐步下降；mRNA相对表达量分别为0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，与对照组（0 nmol/L）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论PP242能够抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的生长，呈浓度和时间依赖性。人晶状体上皮细胞中存在Bcl-2的表达，PP242可下调其表达。

PP242；人晶状体上皮细胞；Bcl-2

白内障摘除术后或晶状体外伤后，残留的皮质或赤道部晶状体上皮细胞增生、向后囊膜移行并化生，形成混浊，称为后发性白内障（posterior capsule opacification，PCO）。多种生长因子、细胞外基质以及细胞凋亡是目前已知的PCO主要分子生物学基础，因此，目前基础研究的重点是如何抑制晶状体上皮细胞增殖并诱导晶状体上皮细胞凋亡。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin，mTOR）信号通路与多种细胞的生长、增殖、分化、凋亡等密切相关，被认为是调节细胞周期进程和凋亡的信号汇聚点［1］。PP242是一种新型的mTOR抑制剂，具有抑制乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞的生长及诱导肿瘤细胞凋亡的作用［2］。本研究拟应用不同浓度PP242对体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04进行处理，观察PP242对人晶状体上皮细胞凋亡基因Bcl-2表达的影响，探讨PP242对PCO的发生发展的作用。

1　材料与方法

1.1材料

人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞株（北京中国科学院肿瘤研究所）；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基（美国Hyclone公司）；PP242（美国LC公司）；MTT试剂（中国碧云天生物公司）；兔抗人β-actin单克隆抗体和辣根酶标记的山羊抗兔lgG二抗（美国Santa Cruz公司）；兔抗人Bcl-2抗体（美国Abcam公司）。

1.2方法

1.2.1MTT法检测SRA01/04细胞生长抑制情况：将对数生长期的细胞用胰酶消化后，将200 μL细胞悬液（约含10 000个细胞）接种到96孔板各孔。细胞贴壁生长后，弃原培养液，用无血清培养液培养12 h。实验孔分别用含100、250、500、750、1 000、1 500 nmol/L PP242培养液处理细胞24 h和48 h，设对照孔（细胞和无血清培养液）和调零孔（无血清培养液），将实验孔、对照孔及调零孔设5个平行孔。每孔加50 μL MTT，室温孵育4 h。用酶标仪测波长490 nm的吸光度值（OD值），重复实验3次。计算细胞生长抑制率（inhibitory rate，IR）=1-（OD实验孔/ OD对照孔）×100%。

1.2.2细胞培养和分组：应用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱内培养SRA01/04细胞。选取对数生长期细胞传代。细胞贴壁生长至亚汇合状态时，更换无血清培养液12 h。将细胞分为对照组和实验组。用含0 nmol/L PP242的培养液培养对照组细胞48 h；分别用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242培养液培养实验组细胞48 h。

1.2.3Western blot检测Bcl-2蛋白表达情况：向各实验组细胞内加入裂解液裂解细胞，4℃、13 000 r/min离心15 min，取上清测蛋白浓度。进行10% SDS-PAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加兔抗人Bcl-2单克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次。加辣根酶标记山羊抗小鼠二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL发光，照相。

1.2.4实时定量RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达情况：提取细胞总RNA并检测浓度。取2 μL RNA （500 ng/μL），逆转录cDNA。取2 μL cDNA模板，3个复孔，2步法实时定量RT-PCR扩增目的基因。βactin上游引物序列5′-GTGGACATCCGCAAAGA C-3′，下游引物序列5′-AAAGGG TGTAACGCAACT AA-3′；Bcl-2上游引物序列5′-GGATTGTGGC CTTCTTTGAG-3′，下游引物序列5′-TACCCA GCCTCCGTTATCCT-3′。根据β-actin与Bcl-2 mRNA表达量标准曲线回归方程及实验组Ct值，计算各实验组β-actin和Bcl-2 mRNA的相对表达量。

1.3统计学分析

2　结果

2.1PP242对SRA01/04细胞生长的抑制情况（表1）

用不同浓度PP242处理SRA01/04细胞24 h、48h后，MTT法检测细胞生长情况，结果显示各组OD值均有统计学差异（P＜0.05）；相同作用时间内，随着PP242浓度升高，OD值逐渐降低，表明对细胞生长的抑制率逐渐升高。相同药物浓度下，随着PP242处理细胞时间的增加，细胞的生长抑制率也逐渐提高。

表1　PP242对SRA01/04细胞生长的抑制情况（n=30,）Tab.1　The influence of PP242 on the proliferation of SRA01/04（n=30,）

表1　PP242对SRA01/04细胞生长的抑制情况（n=30,）Tab.1　The influence of PP242 on the proliferation of SRA01/04（n=30,）

Group　24 h　48 h OD value　IR（%）　OD value　IR（%）Control　0.53±0.19　0　0.63±0.23　0 PP242 100 nmol/L　0.49±0.17　7.55　0.56±0.37　11.11 250 nmol/L　0.48±0.15　9.43　0.48±0.61　23.81 500 nmol/L　0.44±0.17　16.98　0.40±0.13　36.51 750 nmol/L　0.41±0.06　22.64　0.36±0.57　42.86 1 000 nml/L　0.39±0.30　26.42　0.32±0.13　49.21 1 500 nmol/L　0.37±0.22　30.19　0.23±0.24　63.49

2.2PP242处理后SRA01/04细胞内Bcl-2蛋白的表达情况

Western blot结果显示：SRA01/04细胞内有Bcl-2蛋白表达，且PP242浓度越高，Bcl-2蛋白表达水平越低（图1）。各实验组与对照组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　Western blot法检测PP242处理后SRA01/04细胞内Bcl-2蛋白的表达情况Fig.1　Exp ression o f Bcl-2 protein in SRA01/04 treated w ith different concentrations o f PP242 de term ined by Western blot

2.3PP242处理后SRA01/04细胞内Bcl-2mRNA的表达情况

实时定量RT-PCR结果显示：各实验组（250，500，750，1 000 nmol/L）细胞内Bcl-2 mRNA的相对表达量为0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。且随着PP242浓度增加，细胞中Bcl-2 mRNA表达水平逐渐降低。

3　讨论

PCO是白内障摘除术后最常见的并发症。研究［3］表明，成人白内障摘除术后PCO发生率为30%～50%，儿童则为100%。随着现代白内障手术技术日臻完美，人工晶状体设计及材质不断更新，PCO发生率有所下降。目前后囊膜截开术是治疗PCO的行之有效的方法。但由于多数儿童患者自主配合能力较差，无法进行手术治疗，而且可能会出现黄斑水肿甚至视网膜脱离等并发症［4］。因此，PCO的药物防治方法成为目前基础研究的热点。与肿瘤细胞相似，晶状体上皮细胞凋亡能够受到多种炎性因子及生长因子的抑制，因此，越来越多的研究将抗肿瘤药物用于PCO的防治。磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路是细胞生长凋亡过程中的经典的信号通路，激活mTOR通路可诱发肿瘤的生长。研究［6］表明，晶状体上皮细胞的功能状态与mTOR活性密切相关，激活mTOR通路可以抑制晶状体上皮细胞增殖，诱导细胞凋亡。雷帕霉素是经典的PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂，可抑制肿瘤细胞生长，加速细胞凋亡，但其抑制作用具有一定的局限性，只对mTORC1有作用［7］。PP242是一种新型的mTOR抑制剂，通过阻断细胞中负反馈、激活AKT途径，对mTOR通路中mTORC1和mTORC2这2种复合物均有较强的抑制作用，因而，PP242在诱导细胞的凋亡方面比雷帕霉素效果更强［8］。本研究结果显示，PP242对人晶状体上皮细胞的增殖有较强的抑制作用，且在相同作用时间内对细胞生长的抑制率具有浓度依赖性；在相同药物浓度下，对细胞生长的抑制率具有时间依赖性。同时，本研究结果还显示低浓度的PP242即可抑制人晶状体上皮细胞的增殖，高浓度的PP242可产生细胞毒性，引起细胞死亡。而较短时间（12 h）内，PP242对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用并不显著，较长时间（48 h）内，则抑制作用明显。

细胞凋亡是多基因严格控制的过程，其中Bcl-2家族起关键性作用。Bcl-2是AKT下游效应分子中公认的抑制凋亡的原癌基因［9］，Bcl-2蛋白主要分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白2类。Bcl-2是Bcl-2家族蛋白中的抗凋亡蛋白，平时被隔离在线粒体等细胞器内，能够抑制细胞色素c和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放，具有抑制细胞凋亡的功能。而当细胞发生凋亡时，Bcl-2失活，线粒体等细胞器受到破坏，释放出大量的促凋亡因子［10］。本研究结果表明，正常人晶状体上皮细胞中存在Bcl-2蛋白的表达，随着PP242浓度的增加，人晶状体细胞中Bcl-2蛋白的表达逐渐减弱；实时定量RT-PCR检测结果显示，正常人晶状体上皮细胞中Bcl-2mRNA的表达量较高，随着PP242浓度增高，Bcl-2的表达逐渐减弱。因此，PP242使人晶状体上皮细胞中抗凋亡基因Bcl-2的表达水平降低，从而减弱了Bcl-2对人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用。

综上所述，PP242能够抑制人晶状体上皮细胞的增殖，并可能通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达而增加细胞凋亡。然而，在本研究中仅观察到PP242下调Bcl-2表达的现象，而PP242抑制人晶状体上皮细胞增殖、诱导人晶状体上皮细胞凋亡的分子机制仍有待进一步研究。

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（编辑王又冬）

EffectsofPP242on theExpression of ApoptosisProtein Bcl-2 in Human LensEpithelialCells

BAIXue，FENGHao，ZHANGLiu，YANGZhi-bo，NINGHong
（DepartmentofOphthalmology，The FirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveToexplore theeffectsofPP242 on theexpression ofapoptosisprotein Bcl-2 in human lensepithelialcells（HLECs）.MethodsImmortal HLECs SRA01/04 were cultured and treated with different concentrations of PP242.The cell growth was examined by MTT assay at 24 h and 48 h after PP242 treatment.Real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot were adopted to detect the mRNA and protein expression of Bcl-2 respectively.Results The cultured HLECs SRA01/04 were collected and treated with different concentrations（100，250，500，750，1 000，1 500 nmol/L）of PP242.After treatment for 24 h and 48 h，the inhibitory rate in each well was determined by MTTassay.Theinhibition ratewasasbelow，24h：7.55%，9.43%，16.98%，22.64%，26.42%，30.19%；48h：11.11%，23.81%，36.51%，42.86%，49.21%，63.49%.Compared with the control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with the control group（0 nmol/L），the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased with the increasing concentrations of PP242（P＜0.05），while the expression of Bcl-2mRNA was inhibited by PP242 based on the results of RT-PCR.Compared with the control group（0 nmol/L），the RT-PCR results of Bcl-2 mRNA were 0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，respectively（P＜0.05）.ConclusionPP242 could inhibit cell proliferation of HLECs in vitro with a concentration and time depended manner.Bcl-2 protein is expressed in HLECs，which could be down regulated by PP242 treatment.

PP242；human lens epithelial cells；Bcl-2

R776.1

A

0258-4646（2016）04-0324-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.009

辽宁省社会发展攻关计划（2013225303）

白雪（1986-），女，医师，硕士研究生.

宁宏，E-mail：xiaoxiao1998@21cn.com

2015-12-21

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