Vc对猪体细胞克隆胚胎体外及体内发育的影响

周 荣， 罗绿花， 麦然标， 余婉娴， 贺晓燕， 纪红美， 石俊松， 王青来，蔡更元,2，吴珍芳,2*

(1.广东温氏食品集团股份有限公司国家生猪种业工程技术研究中心，广东新兴527439；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642)



Vc对猪体细胞克隆胚胎体外及体内发育的影响

周 荣1， 罗绿花1， 麦然标1， 余婉娴1， 贺晓燕1， 纪红美1， 石俊松1， 王青来1，蔡更元1,2，吴珍芳1,2*

(1.广东温氏食品集团股份有限公司国家生猪种业工程技术研究中心，广东新兴527439；2.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642)

[目的]提高克隆猪的大批量生产效率，优化体外与体内培养体系。[方法]将所获得的猪体细胞克隆胚胎用含不同Vc浓度的培养液培养，比较体外囊胚发育力和囊胚细胞数，筛选出合适的培养浓度，然后用此浓度培养后的胚胎进行体内手术移植，统计克隆猪的分娩率和产仔情况。[结果]克隆胚胎在激活后用40 μg/mL Vc处理22 h，体外培养未显著增加囊胚率，但显著提高了囊胚细胞数。体内移植结果显示，添加Vc未提高妊娠率，但增加了窝均总仔数，克隆效率差异显著。[结论]Vc处理有利于增强体细胞克隆胚的体内和体外发育能力。

Vc；猪；克隆胚胎；发育

克隆胚胎必须在体外培养一段时间后，选择在合适的发育阶段移植到受体母猪体内。虽然体外培养取得了一些成果，但体外培养条件仍不能与体内相比[1]。目前关于改善体外培养条件的研究很多，如气象环境[2]、培养液成分[3]等。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧族，对于体内正常卵母细胞的成熟和胚胎的发育是必需的，它对胚胎的氧化损伤决定于其生产和清除之间的平衡[4]。近年来，已有研究在胚胎体外培养过程中添加小分子抗氧化物质，以降低因过氧化反应应激造成的早期胚胎损伤，有一些抗氧化剂已被用于胚胎的体外培养，包括维生素E[5-6]、谷胱甘肽(GSH)[7]、L-肉碱[8]、和维生素C[9-10]等。Vc又称抗坏血酸，在清除细胞内自由基和调节细胞内氧化还原平衡方面具有重要作用[11]，在ROS对胚胎的保护方面，可以通过减少氧化应激和表观遗传修饰调控，促进小鼠和猪早期胚胎体外发育效率[9-10,12]。笔者在胚胎培养液中添加不同浓度Vc，比较不同浓度Vc对克隆胚胎体外发育和体内移植效果的影响，旨在为提高克隆猪的实际生产效率提供参考。

1　材料与方法

1.1材料猪卵巢采自广州某屠宰场，猪成体成纤维细胞分离自新兴县水台原种场优秀种公猪。细胞培养相关耗材为Corning公司产品；卵母细胞成熟及胚胎培养耗材为NUNC公司产品。

1.2主要试剂卵母细胞培养用试剂均购自Sigma(美国)公司，供体成纤维细胞培养用试剂购自life(美国)公司，胎牛血清(GIBCO，美国)，生理盐水(紫光古汉集团衡阳制药有限公司)。

洗卵液：DPBS+1%PVA液。卵母细胞成熟培养液：TCM-199+10%猪卵泡液(PFF)+10%FBS+10 IU/mL PMSG+10 IU/mL HCG+0.1 μg/mL半胱氨酸+10 ng/mL表皮生长因子(EGF)。体外操作液HN：无钙的H-NCSU-23。融合激活液F：0.25 mol/L Mannitol，0.1 mmol/L CaCl2·2H2O，0.1 mmol/L MgCl2·6H2O，0.5 mmol/L HEPES，0.01% PVA(W/V)。胚胎培养液：PZM-3猪合子培养液。囊胚染色液：含5 μg/mL Hoechst33342的DPBS液。供体成纤维细胞培养液：DMEM+10%FBS。

1.3方法

1.3.1卵母细胞收集及体外成熟培养。猪卵巢采自广州某屠宰场，用剪刀去除输卵管等组织后，将卵巢置于含抗生素的37 ℃生理盐水中，保温3 h运回实验室。用含抗生素的生理盐水冲洗3～5次后，用配有18 G针头的10 mL注射器抽取直径2～6 mm的卵泡，卵泡液置于37 ℃水浴保温的50 mL离心管中。静置15～20 min后去上清，洗卵液稀释后在体视显微镜下用自制捡卵针捡取胞质完整及包裹3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，COCs)。用洗卵液冲洗3次，再用成熟培养液冲洗2次，然后放入已在二氧化碳培养箱内平衡4 h以上的成熟培养液中。在39 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养42～44 h。

1.3.2供体细胞培养。在新兴县水台原种场采集优秀种公猪耳样，经含有双抗的生理盐水冲洗，保存到含双抗的DMEM培养液中，用冰盒带回实验室。耳样在实验室制成细胞悬液，培养细胞，冷冻保存。进行核移植操作前7～14 d，用DMEM+10%FBS将供体细胞复苏培养。将传代至5～6代的成纤维细胞培养至100%汇合，再接触抑制2 d后，常规消化，离心洗涤，最后用操作液将细胞沉淀重悬，用做核供体。

1.3.3克隆胚胎的生产。将成熟培养42～44 h后的卵母细胞与1 mg/mL透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，以胞质均匀、第一极体排出为成熟标志挑选出成熟的卵母细胞，放至操作液滴中备用。采用盲吸去核法构建体细胞克隆胚胎：在显微操作仪上用固定针将卵母细胞固定，去核针拨动使极体处于5：00位置，用去核针将卵母细胞内的极体及附近1/3胞质去除并将体细胞注进透明带内，使其与胞质紧密贴近。将构建好的重构胚恢复30 min后做融合激活：先用融合激活液F洗涤3～5次，再移至已铺满融合激活液的融合槽中，调整重构胚的位置使供体细胞与卵母细胞膜的接触面与电场方向垂直，进行电融合激活。电融合仪型号为BLS-150B，设置参数：场强为80 V，脉冲时间80 μs，脉冲次数2 DC，一次可同时操作15个左右卵母细胞。经过胚胎培养液PZM洗涤3遍后转移至添加5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX的胚胎培养液中辅助激活处理4 h，再在体视镜下判定融合。

1.3.4克隆胚胎的体外培养。 将融合后的克隆胚置于不同Vc浓度(0、20、40 μg/mL)的胚胎培养液中，在39 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养22 h。22 h时换成不含Vc的胚胎培养液继续培养，分别在48和168 h时观察记录卵裂率和囊胚形成率。

1.3.5囊胚细胞染色计数。取出培养168 h的囊胚，在含有3.7%多聚甲醛的DPBS 中洗涤2遍后固定10 min，将固定好的囊胚转移至含10 μg/mL Hoechst33342的DPBS中避光染色5 min，将染好的囊胚用操作液洗3遍，转移至载玻片上，尽量少带液体，用矿物油在载玻片的四角点四个柱，再轻压盖玻片(图1)。然后在Olympus 荧光显微镜下紫外光激发下观察拍照，细胞计数(图2)。

图1　囊胚白光Fig.1　Blastocyst white light

图2　囊胚荧光Fig.2　Blastocyst fluorescence

1.3.6手术移植。以体外培养效果较好的Vc浓度培养克隆胚胎22 h后直接进行手术移植。即将融合后的克隆胚置于含40 μg/mL Vc的胚胎培养液中，在39 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养22 h，22 h后直接将克隆胚移植至同期发情的受体母猪子宫内，妊娠到期后统计分娩率、窝均总仔数及克隆效率(出生总仔数/移植胚胎数)。手术具体操作方法：手术当天对母猪禁食，手术前简单保定母猪，对猪进行全身静脉麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，先用清水清洗手术部位及四周，擦干后先用碘酒大范围消毒，再用75%乙醇脱碘。盖上手术布同时暴露手术部位，沿腹中线切开皮肤、皮下肌肉，然后分离皮下脂肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牵引出子宫和输卵管，检查排卵情况。将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入。然后恢复子宫和输卵管到腹腔内。常规手术缝合，术后连续4 d抗生素消炎。术后记录受体猪的生理情况，并做好B超妊娠检测和受体猪饲养管理工作。

1.4统计分析表1的数据用平均数±SD表示，采用SPSS的卡方进行分析。表2的数据用平均数表示，采用单因素方差分析，P<0.05时差异显著。

2　结果与分析

2.1胚胎培养中添加Vc对克隆胚胎体外发育的影响利用含有不同Vc浓度(0、20、40 μg/mL)的胚胎培养液培养克隆胚胎22 h后换成不含Vc的胚胎培养液，继续培养至168 h。结果见表1。由表1可知，克隆胚的卵裂率和体外囊胚发育之间差异不显著，但Vc添加组的囊胚率比对照组高。Vc添加组的囊胚细胞数明显高于对照组，差异显著；而40 μg/mL浓度组高于20 μg/mL浓度组，但差异不显著。说明添加Vc有利于克隆胚胎的体外发育。

2.2胚胎培养中添加Vc对克隆胚体内发育的影响从手术移植效果看，Vc添加组与对照组分娩率相同，均为57.14%。Vc添加组的窝均总仔与对照组相比差异不显著，但明显高于对照组,特别Vc添加组的克隆效率显著高于对照组。说明添加Vc对于克隆胚胎在体内发育是有利的。

3　结论与讨论

该研究比较了在克隆胚胎的体外培养体系中添加Vc对克隆胚胎的体外发育和体内发育潜能的影响,结果表明，体外培养168 h未显著增加囊胚发育率，但显著提高了囊胚细胞数和克隆胚的体外发育能力。体内移植结果显示，添加Vc也有利于克隆胚胎的体内发育，虽然未提高分娩率，但增加了窝均总仔数和显著提高了克隆效率。

表1　胚胎培养中添加Vc对克隆胚胎体外发育的影响

注：同列数据后不同小写字母表示不同浓度间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercases in the same column indicated significant difference between the treatments (P<0.05).

表2　胚胎培养中添加Vc对克隆胚胎移植效果的影响

注：克隆效率=出生的克隆仔猪数/每头受体的移植，同列不同小写字母表示不同浓度间差异显著(P<0.05)。

Note:Cloning efficiency = Number of born cloned piglets/Number of cloned embryos received by all used recipient sows.Different lowercases in the same column indicated significant difference between the treatments (P<0.05).

提高克隆胚胎质量、改善体外培养体系对于体外胚胎的生产至关重要。体外培养体系面临的一个重要问题是氧分压对卵母细胞和胚胎的影响。为了改善这种情况，可以采用5%O2低氧培养[13]或者添加抗氧化剂[5,7-10]。其中，Vc对于猪而言是一种重要的营养物质，也是一种有效的抗氧化剂，添加到培养液中可以保证适当的ROS水平，同时保护细胞免受氧化性损伤和细胞凋亡。Jeong等[4]在猪核移植胚胎和体外受精胚胎培养液中添加Vc，降低了体外培养胚胎的凋亡指数，提高了囊胚细胞总数。Huang等[9]在培养液中添加适量的Vc,降低了胚胎内的氧自由基，增加了囊胚形成率和囊胚细胞数，降低了细胞凋亡数。Michel等[14]也证实Vc可以提高细胞内谷氨酰胺水平和降低氧自由基浓度，从而提高猪孤雌胚和核移植胚的发育能力，结果差异显著。而在Li等[15]对牛的研究中，得到了不同结果，即添加Vc后可以增加桑葚胚率但降低了囊胚孵化率。

该研究选用的浓度显著提高了体外培养的囊胚细胞数，由于体内培养环境更好，体内移植的克隆胚胎囊胚细胞总数可能也有一个大的提高，表现在克隆动物出生后窝均总仔也有明显提高。但也不可添加过量，Jeong等[4]证实了抗氧化剂Vc和Ve添加于体外培养液中，存在剂量依赖性，且不能同时添加。因为ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧族，对于体内正常卵母细胞的成熟和胚胎的发育都是必需的，它对胚胎的氧化损伤决定于其生产和清除之间的平衡，若超过临界值，抗氧化剂也会有负面影响。具体的分子机制也有一些相关的报道，Huang等[9]用Vc处理可以显著提高体外囊胚发育率，处理胚胎中的组蛋白H4赖氨酸5的乙酰化水平升高，囊胚中的Oct4、Sox2和Kif4的表达量升高。也有可能是通过H3K36me2/3来建立组蛋白去甲基酶与Vc介导的重编程之间的联系[16]。Esteban等[17]研究表明,Vc可以提高小鼠和人诱导多能干细胞iPS产生效率,促进部分重新编程iPS细胞过度至完全重编程状态,且可能是通过减少细胞内抑癌基因p53的完全表达来提高细胞重编程效率。Vc作为一种抗氧化剂用于改善猪克隆胚胎的体外和体内发育质量均是可行的，但具体机制还有待于进一步研究。

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Effects of Vitamin C on the Development of Porcine Somatic Cloned Embryosinvitroandinvivo

ZHOU Rong1,LUO Lu-hua1,MAI Ran-biao1,WU Zhen-fang1,2*

(1.Guangdong Wen’s Food Group Co.,Ltd.,National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry，Xinxing,Guangdong 527439; 2.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong 510642)

[Objective] To improve the ability to generate cloned pigs and to optimize the culture systeminvitroandinvivo.[Method] The porcine SCNT embryos were cultured in the medium with different vitamin C concentrations.Then the blastocyst formation rate and cell number per blastocyst were compared.Proper concentration was screened,which was used to treat cloned embryos.After surgery transfer,farrowing rate and litter size were calculated.[Result] After stimulation,cloned embryos were treated by 40 μg/mL Vc for 22 h; cultureinvitrodid not significantly enhance the blastocyst rate,but the blastocyst cell number was significantly increased.Results ofinvivotest showed that adding Vc did not significantly enhance the pregnancy rate,but increased the average litter size.There were significant differences in the cloning efficiency.[Conclusion] Vc treatment is beneficial to the development of porcine SCNT embryos bothinvivoandinvitro.

Vitamin C; Porcine; Cloned embryos; Development

国家转基因生物新品种培育项目(2016ZX08006002；2016ZX08006003)。

周荣(1983-)，女，湖北荆门人，硕士，从事体细胞克隆技术研究。*通讯作者，教授，从事猪的分子遗传与动物育种研究。

2016-05-31

S 188

A

0517-6611(2016)23-090-03