白藜芦醇改善饮食诱导肥胖斑马鱼脂代谢的研究

冉盖，应力，李琳，邓拓，燕乔乔，应晨江，叶晓蕾

（1.温州医科大学　环境与公共卫生学院，浙江　温州　325035；2.华中科技大学　公共卫生学院营养与食品卫生系，湖北　武汉　430030）



白藜芦醇改善饮食诱导肥胖斑马鱼脂代谢的研究

冉盖1，应力1，李琳1，邓拓1，燕乔乔1，应晨江2，叶晓蕾1

（1.温州医科大学环境与公共卫生学院，浙江温州325035；2.华中科技大学公共卫生学院营养与食品卫生系，湖北武汉430030）

目的：研究白藜芦醇（RSV）对饮食诱导肥胖斑马鱼脂代谢的影响。方法：120条野生型成年雄性斑马鱼（AB系），随机分为4组，即正常喂饲组（Con），正常喂饲+RSV组（Con+RSV），过度喂饲组（DIO），过度喂饲+RSV组（DIO+RSV）。每条鱼正常喂饲虫卵量每天为8 mg，过量喂饲量为每天60 mg，RSV干预剂量为20 μmol/L，每天11 h。实验持续8周。实验结束时测定鱼体长、体质量，计算肥满度，检测血浆甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC），观察肝组织形态。检测鱼体pAMPKα/AMPKα、Sirt1、Cav-1和LC3蛋白表达水平。结果：DIO组斑马鱼体长、体质量和肥满度较对照组分别增加11.7%、61.9%和15.1%（P＜0.01），虽然喂食量和RSV对斑马鱼体长的影响存在交互效应（P＜0.05），但RSV干预对上述指标的影响差异均无统计学意义（P＞0.05）。RSV干预能显著改善过度喂饲诱导的脂肪浸润和肝脏脂滴形成，上调鱼体AMPKα蛋白磷酸化水平及显著提升Sirt1蛋白表达水平（725.8% DIO+RSV组 vs DIO组，P＜0.01），RSV干预同时显著提升自噬标志蛋白LC3-I I的水平（P＜0.05）。结论：RSV在没有影响体长、体质量和血脂的情况下，可以调节饮食诱导肥胖斑马鱼的脂代谢，这可能与pAMPKa/Sirt1/自噬通路有关。

白藜芦醇；自噬；脂代谢；肥胖；斑马鱼

肥胖症（obesity）作为代谢综合征（metabolic syndrome，MS）的主要组分之一，与高血压、糖尿病、冠心病等疾病密切相关，严重危害着人类健康。2010年国际肥胖症研究协会报告显示，全球肥胖症患者达4.75亿，每年至少有260万人死于肥胖及其相关疾病［1］。近年来的研究表明，以白藜芦醇（resveratrol，RSV）和茶多酚等多酚类为代表的植物化学物被认为在预防MS及心血管疾病方面颇具前景，但关键性预防作用机制尚待探明。有研究表明，RSV可以通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPKα）/沉默信息调控因子1 （sirtuins 1，Sirtl）上调微管相关蛋白1轻链3-β （microtubule-associated protein 1 light chain3-β，LC3）表达［2］。LC3是自噬的特异性标记蛋白之一，LC3-I I/I与LC3-I I可反映自噬水平的高低。目前，对于RSV是否通过诱导自噬调节脂代谢尚未阐明。

斑马鱼是一种广泛使用的模式生物，它在饮食诱导肥胖方面与哺乳动物有着共同的病理生理途径［3］。本研究以斑马鱼为对象，观察过度喂饲和RSV干预对斑马鱼脂代谢和AMPKα、Sirt1、窖蛋白-1 （caveolin 1，Cav-1）和LC3等蛋白表达水平的影响，以明确RSV是否通过诱导自噬调节脂代谢。

1　材料和方法

1.1材料 RSV（购于南京春秋生物工程有限公司，纯度≥99%）。血液总胆固醇（total cholesterol，TC）酶法测定试剂盒和血液甘油三酯（triglyceride，TG）酶法测定试剂盒购自普利莱基因技术有限公司。pAMPKα（Thr172）（40H9）和Cav-1（D46G3）抗体购买于Cell Signaling Technology公司；LC3-I I （NB820-59177）购自Novus公司；AMPKα（10929-2-AP）、Sirt1（13161-1-AP）和GAPDH（60004-1-lg）购自Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1实验动物：本研究所用斑马鱼为无病原体AB系，由温州市水域科学与环境生态重点实验室提供。选择120～130 d龄雄性个体作为受试对象。饲养条件参照文献［4］。饲养水温（26±1）℃，pH值为6.5～7.5，电导率保持在450～1 000 μs/cm，光周期为14L：10D。以盐水丰年虫幼体作为饲料，每天定时定量喂饲。每天观察记录鱼的生长情况，及时清除食物残渣和粪便，一直持续至实验结束。

1.2.2 实验设计：120条成年雄性斑马鱼随机分为4组，每组30条：正常喂饲组（Con）、正常喂饲+RSV组（Con+RSV）、过度喂饲组（DIO）、过度喂饲+RSV组（DIO+RSV）。正常喂饲虫卵量为每天8 mg，9：00喂饲1次；过量喂饲虫卵量为每天60 mg，9：00、 12：00、17：00 3次喂饲。RSV干预剂量为20 μmol/L，每天22：00～次日9：00将斑马鱼置于新鲜配制的RSV水溶液中饲养干预11 h，持续8周。

1.3肥满度的测定 待检测斑马鱼禁食24 h后，用滤纸吸干鱼体表面的残留水分，测体长、体质量，计算肥满度（condition factor）。

肥满度=体质量（g）×100/体长（cm）3

1.4血浆TG和TC测定 待检测斑马鱼禁食24 h后，用滤纸吸干鱼体表面的残留水分、断尾，用肝素化毛细管取血，将新鲜血液置于200 μL Eppendorf管，于1 000×g离心5 min得到血浆，-80 ℃保存待用。按试剂盒说明书操作。

1.5肝组织形态学检测 在体视显微镜下将待检测斑马鱼快速解剖摘取肝脏，置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h以上，常规石蜡包埋、切片，厚度为4 μm，再通过脱蜡水化后，苏木精-伊红染色，最后脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。

1.6鱼体pAMPKα/AMPKα、Sirt1、Cav-1和LC3蛋白表达水平检测 在体视显微镜下将待检测斑马鱼快速解剖摘除内脏，去头去尾去脊椎骨后-80 ℃保存备用。Western blot法作蛋白检测：将冻存的鱼体剪碎，用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，100 ℃变性5 min，每个样本取40 μg蛋白，经SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜10 min×3次，分别孵育pAMPKα（1：1 000）、AMPKα（1：1 000）、Sirt1 （1：1 000）、Cav-1（1：1 000）、LC3-I I（1：1 000）和GAPDH（1：5 000），4 ℃过夜，TBST洗膜10 min×3次，二抗（1：5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，最后显影成像分析，计算各蛋白条带和内参（GAPDH）的比值。

2　结果

2.1斑马鱼体长、体质量、肥满度和血脂的改变

喂食量和RSV对斑马鱼体长的影响存在交互效应（P＜0.05）；但对体质量、肥满度、TG和TC的交互效应均无统计学意义（P＞0.05）。在无RSV干预情况下，过度喂饲使斑马鱼体长、体质量和肥满度分别增加11.7%、61.9%和15.1%，差异均有统计学意义（P＜0.01）；但过度喂饲对TG和TC的影响均无统计学意义（P＞0.10）。在正常喂饲情况下，RSV干预可使体长增加1.5%，差异无统计学意义（P＞0.05）；在过度喂饲情况下，RSV干预可使体长平均减少2.5%，差异无统计学意义（P＞0.05）。RSV干预对体质量、肥满度、TG和TC的影响均无统计学意义（均P＞0.10）。见表1。

表1　斑马鱼体长、体质量、肥满度和血脂检测结果（±s）

表1　斑马鱼体长、体质量、肥满度和血脂检测结果（±s）

组别　体长（cm，n=30）　体质量（g，n=30）　肥满度（100 g/cm3，n=30）　TC（mmol/L，n=4）　TG（mmol/L，n=4）Con　3.25±0.15　0.265±0.028　0.781±0.104　4.39±0.51　8.06±1.15 Con+RSV　3.30±0.20　0.277±0.033　0.781±0.125　4.34±0.74　6.14±1.75 DIO　3.63±0.17　0.429±0.052　0.899±0.110　5.13±0.44　6.63±0.94 DIO+RSV　3.54±0.18　0.416±0.055　0.937±0.112　4.31±0.32　7.12±0.32 F喂食＜94.438　362.811　＜44.123　1.833　0.154 FRSV＜ 0.263　＜　0.004　＜ 0.806　2.714　1.531 F交互＜ 4.644　＜　2.365　＜ 0.841　2.075　4.335 P喂食＜0.001　＜0.001　＜0.001　0.201　0.702 PRSV＜ 0.609　＜ 0.953　＜ 0.371　0.125　0.240 P交互＜ 0.033　＜　0.127　＜ 0.361　0.175　0.059

2.2肝脏组织形态学检测 DIO组斑马鱼肝脏观察到脂肪浸润和肝脏脂滴，并且出现肝索结构紊乱。在Con组、Con+RSV组和DIO+RSV组中没有发现肝脏脂滴和肝索结构紊乱现象。见图1。

2.3鱼体pAMPKα/AMPKα、Sirt1、Cav-1和LC3蛋白表达水平的变化 喂食量和RSV对斑马鱼pAMPKα/ AMPKα蛋白表达水平的交互效应无统计学意义（P＞0.05）。喂食量对斑马鱼pAMPKα/AMPKα蛋白表达水平的影响无统计学意义（P＞0.05）；RSV干预使pAMPKα/AMPKα蛋白表达水平增高（P＜0.05），在正常喂饲情况下平均增高204.8%，在过度喂饲情况下平均增高186.5%。见图2A。喂食量和RSV对斑马鱼Sirt1蛋白表达水平的影响存在交互效应（P＜0.01）。在正常喂饲情况下，RSV对Sirt1蛋白表达水平的影响无统计学意义（P＞0.05）；但在过度喂饲情况下，RSV干预可使Sirt1蛋白表达水平增高达725.8%（P＜0.01）。见图2B。

喂食量和RSV对斑马鱼LC3蛋白表达水平的交互效应无统计学意义（P＞0.05）。喂食量对斑马鱼LC3-I I蛋白表达水平的影响无统计学意义（P＞0.05）；RSV干预使LC3-I I蛋白表达水平增高（P＜0.05），在正常喂饲情况下平均增高47.3%，在过度喂饲情况下平均增高100.0%。见图2C。喂食量和RSV对斑马鱼Cav-1蛋白表达水平的影响存在交互效应（P＜0.05）。DIO组Cav-1蛋白表达水平高于Con组（P＜0.05）；在正常喂饲情况下，RSV干预使Cav-1蛋白表达水平增高，但无统计学意义（P＞0.05）；在过度喂饲情况下，RSV干预可使Cav-1蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图2D。

图1　斑马鱼肝脏组织学检测结果（HE染色，×400）

3　讨论

模式动物斑马鱼具有个体小、养殖成本低、生长周期短、体外发育、胚体透明、在解剖学与生理学上与人类具有高度的相似性且其在基因组水平上与包括人类在内的其他脊椎动物具有惊人的相似等优点，已广泛用于生命科学和环境科学等研究领域。肥胖是由遗传和环境因素共同作用而引起的体质量增加、脂肪积聚过多所致的慢性代谢性疾病，严重影响机体健康。肥满度是衡量和反映鱼类肥瘦程度和生长情况的指标，用于分析不同环境对动物营养状况的影响等［5］。本研究通过以每天60 mg喂饲8周后成功诱导了斑马鱼肥胖，表现为体长、体质量和肥满度明显增加，这一结果与Oka等［3］的研究结果相一致。

图2　RSV对斑马鱼鱼体pAMPKα/AMPKα、Sirt1、LC3-I I和Cav-1蛋白表达水平的影响

RSV是一种非黄酮多酚类植物化合物，广泛来源于花生、葡萄、虎杖、桑椹等植物，研究表明它具有抗肥胖作用。Lagouge等［6］和Wang等［7］的研究表明，在RSV长期干预或者高剂量的RSV（200或400 mg·d/kg）作用下，可使得高脂饮食诱导肥胖的小鼠体质量下降。在本研究中，RSV干预（20 mmol/L）在斑马鱼形态学上未见有明显改善，对血脂也未见有明显影响，但肝脏组织学检查发现它能显著改善过度喂饲诱导的脂肪浸润和肝脏脂滴形成。说明RSV能够影响斑马鱼的脂代谢，防止过度饮食诱导的肝脏脂肪变性。

AMPK是对细胞能量代谢敏感的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过调节Sirt1的表达从而调控脂代谢，维持细胞内能量稳态，因此被称为“细胞能量检测器”。AMPK是由α、β、γ 3个亚基组成，其中α为反应亚基，它的Thr172磷酸化是调节其活性的关键位点。本研究结果显示，RSV干预使得pAMPKα/AMPKα表达水平升高，说明RSV激活AMPKα的磷酸化。而磷酸化的AMPKα可以增加NAD+和NAD+/NADH水平，进而增强Sirt1的活性［8］。本研究结果显示，在过度喂饲情况下，RSV干预使Sirt1蛋白表达水平增高。提示在DIO+RSV组中RSV通过激活AMPK的磷酸化水平上调Sirt1蛋白的表达。Sirt1参与自噬调节，通过以NAD+依赖方式与Atg5、Atg7和Atg8形成复合物，使其脱乙酰化，激活自噬［9］，进而参与脂质降解代谢过程［2］。因此，Sirt1能够通过诱导自噬，促进脂质降解代谢。

LC3是自噬特异性的标记蛋白。最近研究表明，LC3-I I以乙酰化的形式存在于细胞核内，而Sirt1通过对其K49和K51位点进行去乙酰化激活LC3［10］。LC3定位自噬体膜上，与Cav-1耦合形成脂筏［11］。Cav-1参与调节细胞内胆固醇的流出，并与LC3结合，维持着自噬和脂代谢的稳态［11］。本研究结果表明，在过度喂饲情况下，RSV干预使LC3-I I表达升高，而Cav-1表达降低，提示在过度喂饲情况下，RSV可能通过下调Cav-1蛋白表达调控脂代谢。但在正常喂饲情况下，RSV的干预同样使LC3-I I表达水平升高，而Cav-1蛋白表达水平却呈增高趋势。这表明在正常喂饲与过度喂饲情况下，RSV对自噬影响的机制不同。

RSV在没有明显影响体长、体质量和肥满度等前提下，可以调节饮食诱导肥胖斑马鱼脂代谢，这种调节作用可能涉及Sirt1/pAMPKa/自噬机制。

［1］葛均波, 徐永健.内科学[M].北京: 人民卫生出版社, 2013: 769.

［2］WU YLI XZHU J Xet al.Resveratrol-activated AMPK/ SIRT1/autophagy in cellular models of Parkinson's disease ［J］.Neurosignals201119（3）163-174.

［3］OKA TNISHIMURA YZANG Let al.Diet-induced obesity in zebrafish shares commonpathophysiological pathways with mammalian obesity［J］.BMC Physiol201010：21.

［4］WESTERFIELD M.The zebrafish book［M］.EugeneUniversity of Oregon Press20003-4.

［5］VERGAUWEN LBENOOT DBLUST Ret al.Long-term warm or cold acclimation elicits a transcriptional response and affects energy metabolism in zebrafish［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol2010157（2）149-157.

［6］LAGOUGE MARGMANN CGERHART-HINES Zet al.Resveratrol improves mitochondrial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-1alpha［J］.Cell2006127（6）1109-1122.

［7］WANG BSUN JLI Let al.Regulatory effects of resveratrol on glucose metabolism and T-lymphocyte subsets in the development of high-fat diet-induced obesity in C57BL/6 mice［J］.Food Funct20145（7）1452-1463.

［8］CHUNG J HMANGANIELLO VDYCK J R.Resveratrol as a calorie restriction mimetictherapeutic implications［J］.Trends Cell Biol201222（10）546-554.

［9］LEE I HCAO LMOSTOSLAVSKY Ret al.A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A2008105（9）3374-3379.

［10］HUANG RXU YWAN Wet al.Deacetylation of nuclear LC3 drives autophagy initiation under starvation［J］.Mol Cell201557（3）456-466.

［11］CHEN Z HCAO J FZHOU J Set al.Interaction of caveolin-1 with ATG12-ATG5 system suppresses autophagy in lung epithelial cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014306（11）L1016-L1025.

(本文编辑：吴彬)

Resveratrol ameliorates the lipid metabolism in the diet-induced obese zebrafish

RAN Gai1YING Li1LI Lin1DENG Tuo1YAN Qiaoqiao1YING Chenjiang2YE Xiaolei1.1.School of Environmental Science and Public HealthWenzhou Medical UniversityWenzhou325035； 2.Department of Nutrition and Food HygieneSchool of Public HealthHuazhong University of Science and TechnologyWuhan430030

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol （RSV） on lipid metabolism in diet-induced obese zebrafish.MethodsOne hundred and twenty adult zebrafish （Danio rerio） of the wild-type strain （AB） were randomly allocated into 4 groupscontrol group （Con）Con+RSVdiet-induced obese （DIO）and DIO+RSV.The Con group was fed on freshly hatched live Artemia （8 mg cysts/fish/day） once a day for 8 weeks.The DIO group was fed on freshly hatched live Artemia （60 mg cysts/fish/day） three times a day for 8 weeks.The fish were exposed to 20 mmol/L resveratrol for 11 hours every day.After 8 weeksthe body lengthbody weighttotal cholesterol （TC）and triglyceride （TG） were measured.The histology of the liver was evaluated.The protein levels of pAMPKαAMPKαSirt1caveolin-1 （Cav-1） and LC3-II were analyzed by western blotting.ResultsAfter 8 weeksthe body lengthbody weight and condition factor increased by 11.7%61.9% and 15.1% （P＜0.01）respectively.There was interaction effect on body length between the food intake and resveratrol （P=0.033）but resveratrol had no effect on the above parameters.Resveratrol could significantly alleviate the fatty infiltration and the formation of lipid droplets in the liverand resveratrol up-regulated protein levels of pAMPKαSirt1 （725.8% DIO+RSV group vs.DIO groupP＜0.01） and autophagy marker protein LC3-II （P=0.047）.ConclusionWithout affecting the body lengthbody weight and lipid parametersresveratrol ameliorates the lipid metabolism via pAMPK/Sirt1/autophagy pathway in the diet-induced obese zebrafish.

resveratrol； autophagy； lipid metabolism； obesity； zebrafish

R151.3

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.005

2015-12-08

国家自然科学基金资助项目（81273060，81373007）。

冉盖（1989-），男，四川达州人，硕士生。

叶晓蕾，教授，硕士生导师，Email：yexiaolei@wmu.edu.cn。