双孢蘑菇培养料中纤维素降解菌的分离与纯化*

2016-09-28郭仲杰李洪荣陈美元蔡志欣廖剑华

福建轻纺 2016年12期

关键词：秸杆培养料纤维素

郭仲杰，李洪荣，陈美元，蔡志欣，廖剑华

（福建省农业科学院食用菌研究所特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建福州 350014）

双孢蘑菇培养料中纤维素降解菌的分离与纯化*

郭仲杰，李洪荣，陈美元，蔡志欣，廖剑华

（福建省农业科学院食用菌研究所特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建福州 350014）

实验从双孢蘑菇一、二次发酵培养料样品中，分离筛选出10株有降解纤维素能力的菌株。经过透明圈直径、酶相对活性、滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力的测定、比较，复筛出3株降解纤维素能力相对较强的菌株，分别是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。

双孢蘑菇；培养料；纤维素降解菌；酶活力

在我国农业生产中，每年产生了大量的农作物秸杆如小麦秸杆、稻草等，由于其主要成分木质素、纤维素和半纤维素的分子结构稳定，难以有效利用，除少量用作饲料，大部分都是被直接焚烧、废弃，不仅造成巨大的资源浪费,而且还引起了严重的环境污染问题[1-3]。近年来，迅速发展的食用菌产业对秸杆的利用发挥了重大作用，用来栽培双孢蘑菇[4]、巴西蘑菇[5]等多种食用菌，菌渣回田，变废为宝，实现无害化循环利用。

双孢蘑菇[Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach]是一种草腐生食用菌[6]，其菌丝不能直接利用纤维素，秸杆必须经过堆制发酵才能被利用。培养料堆制发酵是在一定的环境条件下，由原料自身或空气中所带有的微生物的生长代谢而引发的一种高温、好氧的生物降解过程；微生物繁殖活动是降解或转化纤维素的关键。本研究将双孢蘑菇培养料样品进行分离，筛选出纤维素降解菌，并对其酶活力和对纤维素的降解能力的测定，复筛出高效纤维素降解菌，用于双孢蘑菇培养料的促酵作用和发酵质量的检测研究。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与预处理

采集不同发酵阶段、不同位置的双孢蘑菇培养料样品。分别放入三角瓶中，加入适量无菌水和玻璃珠，振荡30min,无菌纱布过滤，提取清液，以备待用。

1.2 培养基和试剂的配制

纤维素筛选培养基[7]：蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10.0g，NaCl 5.0g，KH2PO4 1.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

鉴别培养基（纤维素刚果红培养基）[8]：纤维粉1.88g，KH2PO4 0.50g，MgSO4·7H2O 0.5115g，刚果红0.20g，琼脂16.0g，明胶2.0g，双孢蘑菇培养料浸出汁100mL，pH值7.0。

液体培养基[9]：蛋白胨3.0g，酵母膏0.50g，羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5.0g，NaCl 5g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl·2H2O 0.3 g，pH值7.2～7.3 蒸馏水1000mL。

试剂：按照文献[10]分别配制3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）、柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液和1mg·mL-1葡萄糖标准溶液。

1.3 纤维素降解菌的分离、筛选及纯化[11-12]

将样品清液的10-3、10-4、10-5倍稀释液均匀涂布于纤维素筛选平板培养基上，50℃培养箱倒置培养3～5d，随时观察。及时将平板上的菌落挑取，划线分离得到的单菌落，接种于纤维素刚果红培养基上，50℃培养箱倒置培养3～7d。挑选出在平板上生长快，透明水解圈大的单菌落，接种于CMC斜面培养基上，保藏，以备进一步研究。

1.4 纤维素降解菌酶活力测定

1.4.1 纤维素降解菌酶相对活性测定

将分离纯化得到的单个菌株分别接种于纤维素刚果红培养基上，50℃培养箱倒置培养5d，并测定记录透明圈直径(D)和菌落直径(d)大小。

酶相对活性(A)=D/d

1.4.2 酶活力的测定[13]

1.4.2.1 粗酶液的制备

将分离到的菌株分别接种到装有200ml液体培养基的三角瓶中，50℃，180r·min-1振荡培养5 d，将培养液于4℃，4000r·min-1离心15 min，取上清液作为粗酶液。

1.4.2.2 标准曲线的绘制

采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法测定酶解液中还原糖的含量。分别取1mg·mL-1葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL，依次加入9支20mL的比色试管中，用蒸馏水稀释到2.0mL，再加入DNS试剂1.5mL，在100℃水浴5min，冷却，用蒸馏水定容至20mL摇匀，在波长520nm 处进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录吸光度值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.2.3 滤纸酶活力测定

取0.15mol·L-1HAc-NaAc缓冲液1.5mL，加入新华定量滤纸1条（1cm×6cm、50±1mg），再加入粗酶液0.5mL，摇匀，滤纸浸泡在液体中，50℃水浴保持1h，按DNS法测定糖。

以1mL酶液60min催化水解生成 1μmol葡萄糖的所需的酶量为1个酶活力单位，单位为U。

1.4.2.4 羧甲基纤维素酶 ( CMC) 酶活力测定

试管中加入1.5mL含0.5% CMC-Na的柠檬酸缓冲液，再移取入0.5mL粗酶液，摇匀，50℃水浴反应30min后，按DNS法测定糖。

以1mL酶液30min催化水解生成 1μmol葡萄糖的所需的酶量为1个酶活力单位，单位为U。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离与纯化、筛选

使用结构简单，较易降解的羧甲基纤维素钠作为单一碳源的选择性培养基，进行初步筛选纤维素降解菌。用1mol·L-1的HCl染色，如果菌株有降解纤维素能力，则会水解双糖，红色水解圈沉淀变为深蓝色，说明该菌株是纤维素降解菌。按此方法，分离得到36株具有降解纤维素能力的菌株，其中从一次发酵培养料筛选出11株，二次发酵培养料筛选出25株，结果表明二次发酵培养料内优势生长的纤维素降解菌多于一次发酵培养料。

将分离纯化得到的36株纤维素降解菌接种在纤维素刚果红平板培养基上，50℃生化培养箱培养5d，观测其透明圈的直径并计算其相对酶活力，筛选出10株相对分解能力较强的菌株，分别命名为Ⅰ-1，Ⅰ-2，Ⅰ-3，Ⅱ-1，Ⅱ-1，Ⅱ-2，Ⅱ-3，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅱ-6，Ⅱ-7（Ⅰ代表一次发酵培养料，Ⅱ代表二次发酵培养料）。

2.2 纤维素降解菌酶活力测定

刚果红纤维素平板透明圈筛选法简便、快速、直接，如果作为唯一定量指标，其精确度不可靠，需要配合其他方法。纤维素酶活力是衡量菌株降解纤维素能力的一个定量指标，酶活力越高，菌株降解纤维素的能力就越强。分别对10株纤维素降解菌进行透明圈测定、酶相对活力、滤纸酶活力和CMC酶活力进行测定，结果如表1。

表1的测定结果表明，酶相对活力最大是Ⅱ-4，滤纸酶活力最大是Ⅱ-6， CMC酶活力最大是Ⅱ-5。各菌株的透明圈大小、酶相对活性、滤纸酶活力和CMC酶活力的测定结果一致性较好。另外CMC酶活力高的菌株，其滤纸酶活力，CMC 酶活力也高。

通过纤维素选择培养基初筛，刚果红纤维素平板透明圈筛选和液体发酵筛选的复筛，再进行培养、酶活测定的验证，能够快速、准确、有效地筛选出高纤维素降解能力的菌株。刚果红纤维素平板透明圈筛选法可用于识别产纤维素降解酶的菌株外，还可用于初步判定酶活力的高低，大大地减轻了筛选工作量。

表1 菌株不同指标的测定结果

3 结论与讨论

实验发现在双孢蘑菇培养料堆制发酵过程中，有大量的纤维素降解菌繁殖活动，分离出38株具有降解纤维素能力菌株，初筛出10株在酶活力较好的菌株，复筛出3株降解纤维素能力相对较强的菌株，分别是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。

双孢蘑菇培养料主原料是农作物秸杆，主要成分为纤维素和木质素。双孢蘑菇菌丝不能直接利用纤维素和木质素，原料必须堆制发酵，经过纤维素降解菌和木质素降解菌的降解作用，制造出适合双孢蘑菇菌丝生长的特异性基质。在这过程中，双孢蘑菇培养料的物理结构的变化和化学成分的转化与微生物的繁殖活动复杂地结合在一起。本试验筛选出的菌株，可用于配制双孢蘑菇的促酵剂，对增加纤维素降解菌的繁殖优势，提高培养料质量，增加双孢蘑菇生产效益有重大意义。试验对研究双孢蘑菇培养料内降解菌繁殖活动变化情况，探索培养料发酵质量的检测新方法提供了基础。

[1] 聂麦茜,刘加昌,朱玉玺,等.纤维素降解菌筛选分离与CMC酶提取及其活性研究[J].安徽农业科学，2008,36（19）:7956-7958,8002.

[2] 曲昭令,贾国清,李玉恒.平方米秸杆栽培双孢蘑菇发酵工艺的初步研究[J].当代生态农业,2003，（1）:12-14.

[3] 陈洁,武高潮,王涛.利用玉米秸杆栽培双孢蘑菇关键技术[J].西北园艺（蔬菜专刊）,2009（4）：22-23.

[4] 黄毅.食用菌栽培[M].北京:高等教育出版社,2008.

[5] 吕作舟.食用菌栽培学[M].北京:高等教育出版社,2006.

[6] 孔祥君,王泽生.中国蘑菇生产[M].北京:中国农业出版社,2000.

[7] 谢正曙.现代微生物培养基和试剂手册[M].福州:福建科学技术出版社,1994.

[8] 叶姜喻.一种纤维素分解菌鉴别培养基[J].微生物学通报,1997,24(3):251-252.

[9] 曾青兰.纤维素分解菌的分离筛选[J].安徽农业科学,2007,35(36):11946-11947.

[10] 李振红,陆贻通.高效纤维素降解菌的筛选[J].环境污染与防治,2003,25(3):133-135.

[11] 李日强,辛小芸.天然秸杆纤维素分解菌的分离选育[J].上海环境科学,2002,21(1):8-11.

[12] 周德庆.微生物学实习手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986.