高产纤维素木醋杆菌的筛选及其发酵工艺优化

王良

（黑龙江生物科技职业学院，黑龙江哈尔滨150025）

高产纤维素木醋杆菌的筛选及其发酵工艺优化

王良*

（黑龙江生物科技职业学院，黑龙江哈尔滨150025）

我国细菌纤维素生产存在的主要问题有产量低、成本高等。本实验通过诱变筛选出一株较佳产细菌纤维素生产菌，利用玉米糖化液为碳源，对其发酵工艺进行优化研究，获得了较好效果，对于提高细菌纤维素产量，降低发酵成本均有较好的效果，也为细菌纤维素的工业化生产提供了理论依据和实践基础。

木醋杆菌；诱变；发酵

目前，细菌纤维素的生产成本较高。究其原因，一方面是传统方法需使用的培养基较昂贵，导致生产成本过高，难以产业化[1-3]；另一方面是传统方法多使用浅盘发酵，缺乏具有转化效率高、产量高、遗传性状稳定并可用于液体深层发酵的菌种[4]。本文采用传统的紫外线诱变筛选高产细菌纤维素菌株，以玉米为原料对其发酵工艺进行优化，以获得最大产量，节约生产成本，并为黑龙江省的玉米深加工提供新的途径，为今后中试或工业化生产提供实验支持，并奠定理论基础。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 试验菌株

木醋杆菌（Acetobacter xylinus）Mc-5，黑龙江轻工科学研究院保藏。

1.1.2 培养基

种子培养基配方：玉米糖化液2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%。发酵培养基配方：玉米糖化液5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，硫酸镁0.2%。

1.1.3 试剂与仪器

试剂均为分析纯，进口或国产。

YXQ-SG46-280S手提式高压灭菌锅（上海医用核子仪器厂）；PY60s恒温振荡培养器（武汉汇诚生物科技有限公司）；GT10-1高速离心机（北京时代北利离心机有限公司）；UV2401紫外分光光度计（日本岛津公司）；WS2-134-75培养箱（上海跃进医疗器械厂）；PHB-4 pH计（上海精密仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

将从冰箱冷冻保存的菌种转接到种子固体平板培养基上，30℃恒温培养3d，进行划线分离，然后挑取单菌落转接到斜面培养基上，30℃恒温培养24h，放置于-4℃冰箱中保存备用[5]。

1.2.2 紫外线诱变与筛选

1.2.2.1 诱变

取经过0.6u/mL青霉素预处理1.5h的菌液5mL于离心管中，4 000r/min离心，取上清液，用高渗液洗涤2次，配成高渗菌悬液，加入1.0rag/mL溶菌酶于34℃保温15.0h，离心洗涤，用高渗液悬浮，制成原生质体高渗悬浮液。采用15W紫外灯，距离30cm，照射0～120s，边搅拌边照射，力求使菌体均匀吸收紫外线光波。以上照射过程在暗室中进行，以免光修复。将经过紫外线诱变后的菌体转入到无菌试管中，并立即浸入冰水中l.0h。在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率[6]。采用夹层法于32℃恒温箱中培养48h，根据菌落计数，绘制原生质体紫外诱变致死率曲线[7]。根据所获得的最佳紫外诱变剂量处理高渗菌悬液，然后涂布到平板上进行培养。

1.2.2.2 筛选

1）发酵培养。从培养至对数生长期的平板上随机挑取50个单菌落接种到装有富集培养基的试管中，在28℃培养5d后，挑取10支长膜较好的试管中的菌体用摇瓶进行复筛。将10支试管中的菌株分别接种到盛有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃下培养5d，提取产物，干燥称重，保存产细菌纤维素能力较强的菌株。2）纤维素的提取及产量测定。当发酵产细菌纤维素结束时，先将发酵液在高速离心机中以3 000r/min的速度高速离心20min后倒掉上清液，取离心沉淀物用4% NaOH溶液在100℃沸水浴中加热30min去除菌体蛋白，再离心取沉淀，加入适量中性洗涤液在100℃的水浴中加热1h以除去沉淀物质中的杂糖和脂类等杂质，然后用去离子水和0.5%乙酸反复冲洗，最后80℃烘干24h，冷却至室温进行称量。3）残糖浓度的测定。残糖浓度的测定采用DNS法[8]。4）残氮浓度的测定。发酵液中残氮的测定用考马斯亮蓝结合法[9]。5）pH的测定。利用pH计测定发酵液的pH值。6）菌种筛选。经综合分析，挑选细菌纤维素产量高，发酵液残糖和残氮含量低、产酸较少的菌株。

1.2.3 连续传代实验

将紫外诱变筛选的菌株传代5次，每代分别进行发酵并检测其产细菌纤维素的量，从而确定最佳发酵出发菌株。

1.2.4 细菌纤维素的提取及产量测定

当发酵产细菌纤维素结束时，先将发酵液在高速离心机中以3 000r/min的速度高速离心20min后倒掉上清液，取离心沉淀物用4% Na0H溶液在100℃沸水浴中加热30min去除菌体蛋白，再离心取沉淀，加入适量中性洗涤液在100℃的水浴中加热1h以除去沉淀物质中的杂糖和脂类等杂质，然后用去离子水和0.5%乙酸反复冲洗，最后80℃烘干24h，冷却至室温进行称量[10]。

1.2.5 发酵工艺条件优化研究

1.2.5.1 发酵方法

发酵在1L三角瓶中进行，每个试验重复3次。

1.2.5.2 氮源及其浓度的确定

1）取活化好的斜面菌种接入种子培养基，28℃下振荡培养14h，然后使用4%的接种量接入分别以1%酵母膏、蛋白胨、玉米浆为氮源的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。2）以所确定的氮源按不同的梯度浓度加入到发酵培养基中，然后以4%的接种量接入到培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

1.2.5.3 接种量的确定

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃振荡培养14h，然后分别以1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%的接种量接入发酵培养基中，30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

1.2.5.4 培养时间的确定

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃振荡培养14h，然后以4%的接种量接入发酵培养基中，于30℃振荡培养1、2、3、4、5、6d和7d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

1.2.5.5 培养使用有机酸的确定

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加了0.1%的柠檬酸、醋酸、乳酸的发酵培养基中，于30℃恒温振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

1.2.5.6 单因素实验分析

1）初始pH对纤维素产量的影响

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下恒温振荡培养14h，然后以4%的接种量接入pH分别 为2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接种发酵培养基培养，分别在24、27、30、33、36℃和39℃的温度下振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

3）通风量对细菌纤维素产量的影响

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接种发酵培养基培养，分别在转速50、100、150、200、250r/min和300r/min下振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

4）有机酸对细菌纤维素产量的影响

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加实验确定的不同量的有机酸，比较实验结果。

5）乳酸盐对纤维素产量的影响

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加了0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和 0.30%的乳酸盐的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，提取细菌纤维素，干燥称重，比较实验结果。

2 结果与讨论

2.1 紫外诱变筛选结果

2.1.1 紫外致死曲线

“假设你参加了一份兼职可获得100元作为报酬，但是这份报酬要延迟1个月后给你，你认为1个月后，至少给你________元，你会感到满意？”被试还需面对延迟3个月、6个月和12个月的类似情境并进行作答(张柏宁，2012)。

采用15W紫外灯，距离30cm，照射0、20、40、60、80、100s和120s，边搅拌边照射，力求使菌体均匀吸收紫外线光波。以上照射过程在暗室中进行，以免光修复。将经过紫外线诱变后的菌体转入到无菌试管并立即浸入冰水中1h。在低温条件下，细胞内参与对突变体修复的各种酶类活性受到抑制，使修复难以进行，有利于提高突变率。采用夹层法于32℃恒温箱中培养48h，根据菌落计数，绘制原生质体紫外诱变致死率曲线，所得曲线如图1所示。

图1 木醋杆菌紫外辐射致死曲线

由图1可知，随着时间的延长，细菌的致死率增加，当照射时间达到120s时致死率几乎达到百分之百。考虑到一般致死率在70.00%～75.00%为宜，故选取照射时间为80s。

2.1.2 菌株的细菌纤维素产量

图2 紫外诱变优选10株木醋杆菌细菌纤维素产量

从培养至对数生长期的平板上随机挑取50个单菌落接种到装有富集培养基的试管中，在28℃培养5d后，挑取10支长膜较好的试管中的菌体用摇瓶进行复筛。将10支试管中的菌株分别接种到盛有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃下培养5d，提取产物，干燥称重，结果如图2所示。

从图2可以看出，10个菌株的产纤维素能力各异，其中6#、7#、9#号菌产纤维素能力较强，6#菌株为最强，以其为本组研究菌株。

2.1.3 残糖测定结果

如表1所示，残糖较少的发酵菌株分别为4#、6#、9#，表明这3个菌株在发酵过程中对糖的利用较高，能减少养料的浪费。

表1 紫外诱变优选10株木醋杆菌发酵液残糖含量

2.1.4 残氮测定结果

如表2所示，残氮含量较少的菌株分别为1#、6#、9#，同时也可看出残氮与残糖有大致的线性关系，这也验证了微生物生长需要一定的C/N比。

表2 紫外诱变优选10株木醋杆菌发酵液残氮含量

2.1.5 pH测定结果

pH的测定结果表明的是菌株产醋酸的含量，如果菌株产醋酸含量过高，菌株用于生成纤维素的能量过少，因此，在判断一个菌株是否有较高产纤维素潜力时，应考虑其产醋酸的能力。如表3所示，产酸较少的菌株有4#、6#、7#。

表3 紫外诱变优选10株木醋杆菌发酵液最终pH值

2.1.6 筛选结果

综合纤维素产量，培养基的残糖，残氮与pH结果，可以看到6#菌株的产纤维素含量最高而残糖、残氮均较低，产酸能力也较低，因此是一个较好的产细菌纤维素菌株，命名为SW-6。

2.2 连续传代实验

以紫外诱变获得的菌株SW-6传代10次，在每次传代后均进行发酵并检测细菌纤维素产量，由此判断菌株的遗传稳定性，并根据遗传稳定性来确定发酵工艺优化实验的出发菌株。

根据表4的结果可以看出，SW-6菌株稳定，因此选择SW-6菌株作为发酵工艺优化的出发菌株。

表4 SW-6菌株5次传代发酵生产细菌纤维素比较

2.3 发酵工艺条件的研究

2.3.1 氮源及其浓度

2.3.2.1 氮源的确定

菌种接入分别以1%酵母膏、蛋白胨、玉米浆为氮源的发酵培养基，30℃振荡培养5d，进行发酵实验，其结果如图3所示。

图3 3种氮源对细菌纤维素产量的影响

从图3可以看出，玉米浆对提高纤维素产量的影响最大。进一步研究化学组成后发现，玉米浆中含有乳酸盐，而其他两种氮源中未含有此成分。作用机制可能是乳酸盐参与了TCA循环，在生长早期乳酸盐可促进代谢流从纤维素合成转向TCA循环，产生更多能量，加速细胞生长，从而提高整体的纤维素产量。

2.3.3.2 氮源浓度的确定

如图4所示，随着玉米浆浓度的增大，细菌纤维素产量逐渐增大，但当选择1.4%的浓度时，增大的幅度渐趋平缓。基于成本考虑，选择1.2%作为玉米浆的加入浓度。

图4 玉米浆浓度对细菌纤维素产量的影响

图5 接种量对细菌纤维素产量的影响

2.3.2 接种量的确定

取活化好的菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后分别以不同的接种量接入发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，其发酵结果如图5所示。

从图5可以看出，随着接种量的增加，纤维素的产量也同时增加。但考虑到今后工业化生产的工艺安排，如果接种量选择过大，会造成种子培养采用多级放大培养，不仅增加投资，也加大了杂菌污染的机会，因此确定接种量为4%。

2.3.3 培养时间的确定

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃振荡培养14h，然后以4%的接种量接入发酵培养基中，于30℃振荡培养l、2、3、4、5、6d和7d，其发酵结果如图6所示。

图6 培养时间对细菌纤维素产量的影响

从图6可以看出，纤维素的产量随着发酵时间的延长而增加，但是发酵5d后，虽然发酵时间继续延长，但纤维素的产量并没有明显增加，可以认为发酵结束。考虑到设备的利用率，选择发酵时间为5d。

2.3.4 培养使用有机酸的确定

取活化好的斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接入添加了0.1%的柠檬酸、醋酸、乳酸的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，实验结果如图7所示。

图7 3种有机酸对细菌纤维素产量的影响

2.4 单因素实验分析结果

2.4.1 初始pH的对纤维素产量的影响

分别在pH为2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，其发酵结果如图8所示。

图8 发酵液初始pH值对细菌纤维素产量的影响

图9 发酵温度对细菌纤维素产量的影响

从图8可以看出，初始pH对细菌纤维素产量的影响情况。培养基pH值在5.0～6.0时纤维素的产量较高，这与有关文献报道中提到细菌纤维素发酵产生细菌的初始pH需要7.0以下相符合，因而确定发酵初始pH值为6.0。

2.4.2 培养温度对纤维素产量的影响

将活化好SW-6的斜面菌种接入种子培养基，以2%的接种量接种发酵培养基培养，分别在24、27、30、33、36℃和39℃的温度下振荡培养5d，发酵结果如图9所示。

从图9可以看出，过高和过低的培养温度对纤维素的产量影响较大，最佳的培养温度为30℃。

2.4.3 摇床转速对纤维素产量的影响

取活化好的SW-6斜面菌种接入种子培养基，30℃下振荡培养14h，然后以4%的接种量接种发酵培养基培养，分别在转速50、100、150、200、250r/ min和300r/min下振荡培养5d，结果如图10所示。

图10 摇床转速对细菌纤维素产量的影响

图11 醋酸浓度对细菌纤维素产量的影响

从图10中可以看出，摇床转速对细菌纤维素的产量有很显著地影响。在低转速的情况下，纤维素的产量随转速的加大而提高，当摇床转速达到200r/min，纤维素的产量最高为9.6g/L，随转速的进一步提高，纤维素的产量反而下降。这主要由于随着转速的增加，剪切力加大，影响了纤维素立体结构的形成，导致产量下降。

2.4.4 有机酸对纤维素产量的影响

从图11中可以看出，添加有机酸对提高纤维素的产量有一定的促进作用，其中醋酸的效果最好。因此，对醋酸的添加量进行了进一步研究，最终确定醋酸的添加量为0.1%。

2.4.5 乳酸盐对纤维素产量的影响

在不同氮源的研究中发现乳酸盐对纤维素的产量有促进作用，因而进行了乳酸盐的添加实验。以4%的接种量接入添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%的乳酸盐的发酵培养基中，于30℃振荡培养5d，实验结果如图12所示。

图12 乳酸盐浓度对细菌纤维素产量的影响

从图12可以看出，乳酸盐对纤维素的产量有一定的促进作用，但添加量达到0.15%以上，纤维素的产量并没有明显的增加。

3 结论与展望

3.1 结论

经对木醋杆菌进行紫外诱变和氯化锂－紫外复合筛选，获得了一株细菌纤维素高产菌SW-6；用玉米糖化液培养木醋杆菌，获得了比利用传统培养基更高的细菌纤维素产量；单因素分析，确定了木醋杆菌SW-6的最佳产细菌纤维素的玉米浆浓度为1.2%，接种量为4%，培养时间5d，使用的有机酸为醋酸。

3.2 展望

目前，通过诱变方法筛选优良菌种是获得优良菌种的一个快捷、有效的途径。诱变方法包括物理诱变和化学诱变。其中，物理诱变中的紫外线诱变是最常用的一种方式。紫外线诱变具有操作简单、成本低廉等优势，但值得注意的是，紫外诱变须在暗处进行，以免发生光修复。另外，由于微生物正突变率极低，仅0.05%～0.20%，产量提高10%以上突变株一般也只有1/300，所以挑选的菌落愈多，概率就愈高，但工作量也愈大，特别是产物的测试工作。一个高产菌株的获得要经过连续多代累积诱发才能达到目的。该实验以木醋杆菌为生产菌进行紫外诱变，通过大量试验筛选出10株优势菌后再进行发酵测试，获得最佳诱变菌种，取得了良好效果。但是，由于试验是在较短的时间并在实验室完成的，关于本菌种的实际工业化生产中的细菌纤维素产量如何和其遗传稳定性如何，还有待进一步研究。

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Screening of High Cellulose Producting Acetobacter xylinum and Optimization of Its Fermentation Process

Wang Liang*
(Heilongjiang Vocational College of Biology Science and Technology, Heilongjiang Harbin 150025)

The major problems in bacterial cellulose production in China are high cost, low yield, etc. A perfect strain was obtained through mutation, and the ferment process was optimized using corn syrup as nitrogen source in this study. This study made achievement in improving the bacterial cellulose yield and reducing the fermentation costs, and thus had great significance in theory and application.

Acetobacter xylinum; Mutation; Fermentation

TS201.5

A

2096-0387（2016）02-0020-06

王良（1981-），男，黑龙江绥化人，硕士，讲师，研究方向：发酵工程。