西藏沙棘茎尖组织快繁技术初步研究

宋维秀，昂毛吉，朋毛卓玛

（青海大学农牧学院，西宁 810016）

西藏沙棘茎尖组织快繁技术初步研究

宋维秀，昂毛吉，朋毛卓玛

（青海大学农牧学院，西宁 810016）

本文以幼嫩茎尖为外植体，对西藏沙棘进行了组织培养成苗技术研究。结果表明，西藏沙棘茎尖生长最适宜的基本培养基为1/2 MS；茎尖生长最佳生长调节剂浓度配比为：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.l mg/L；蔗糖浓度为2.0 mg/L时西藏沙棘茎尖生长苗高均值最大，达到2.82 cm。茎尖在增殖生长过程之中，适当的转接周期能改善芽苗枯死现象。转接周期为15 d时，芽苗枯死率最低为16.33%；当转接周期延长至30 d时，芽苗枯死率明显升高，达到52.67%。

西藏沙棘；茎尖；外植体；组织快繁

西藏沙棘（Hippophae thibetana），胡颓子科沙棘属小灌木，集中分布于青海、西藏、四川等地，具有独特经济价值和水土保持作用的高寒地区乡土造林树种［1］。因其适宜干燥寒冷风大的高原气候特点，一般植株矮小，分布于海拔5 000 m以上高寒地区的植株高仅6～8 cm，且对土壤水分要求不严，不仅在潮湿的阴坡有分布，在土壤干旱的小阳坡地也有分布，其水平根系发达，萌蘖力强［2］。

西藏沙棘繁育主要通过种子和枝条扦插进行繁殖［3］，而有性繁殖难以保持其种性，用无性繁殖技术通过枝条扦插繁殖成苗率也比较低，且扦插繁育多代后年龄效应明显，易受病毒侵染。这些繁殖技术都成为西藏沙棘良种繁育推广的障碍［4-5］。实践证明，组织快繁技术已经成为苗木规模化生产、开展基因遗传育种、保存种质资源研究的高效途径之一［6-7］。迄今为止，西藏沙棘组织快繁技术国内外尚未见研究报道，因此对西藏沙棘进行组织快繁技术研究具有一定的理论与实践意义。本文以西藏沙棘茎尖为外植体，研究分析不同培养基种类、蔗糖浓度、生长调节剂（6-BA）浓度与生长素（NAA）浓度配比、转接周期等对茎尖生长的影响，为西藏沙棘组织培养提供一定的理论和实践基础。

1 试验材料与方法

1.1 材料

试验材料来源于青海省湟源县大石崖村，2013 年3月将野生西藏沙棘苗移栽至大田驯化，2013年10月将其移栽至花盆，并置于实验室培养。

1.2 设计方法

1.2.1 外植体处理

经过盆栽后，选择西藏沙棘长势较好的枝条，剪取1～2 cm带有腋芽的茎尖，放入容器杯中依次用自来水、肥皂水、蒸馏水清洗。冲洗完毕后，将材料置于超净工作台上，接着用70%的酒精消毒10 s，再用0.1%HgC12溶液灭菌5～6 min，最后用无菌水冲洗4～5次。

1.2.2 基本培养条件

参照相关的文献资料［8］，各试验中培养温度均为（25±2）℃，相对湿度70%～80%，培养基pH值5～6，琼脂粉2.25 g，每日光照12～14 h，光照强度1 000～5 000 1x，采用完全随机区组设计，每处理15瓶，每瓶接种2～3个茎尖。

1.2.3 培养基筛选

参照西藏沙棘组织培养技术，以WPM、1/4MS、1/2MS为基本培养基［5］，每处理接种15瓶，25 d后观察西藏沙棘嫩茎生长状况。以西藏沙棘茎尖生长均值为试验指标，采用单因素对比试验，筛选出最适宜于西藏沙棘茎尖生长的培养基。

1.2.4 生长调节剂筛选

按西藏沙棘组织培养中比较适宜的生长调节剂组合及浓度梯度配比［4］，在筛选出的基本培养基中添加不同浓度的生长素组合，6-BA设置4个水平，分别为：0、0.5、1.0、2.0 mg/L；NAA设置3个水平，分别为：0、0.1、0.5 mg/L；20 d后观察芽苗生长状况。每处理均为15瓶，每瓶接种3～5个生长健壮的茎尖，选择出适宜的6-BA和NAA浓度配比。

1.2.5 蔗糖浓度筛选

蔗糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，在适宜的培养基中加入不同浓度的蔗糖（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L），每种处理接种5～6瓶，20 d后观察苗高的生长状况，统计顶芽增高均值，通过顶芽增高生长的影响，确定最佳的蔗糖浓度。

1.2.6 转接周期试管苗生长的影响

在芽苗生长过程中，不同转接周期会对芽苗的生长有很大影响。为了克服转接周期对芽苗枯死的影响，试验以1/2MS为基本培养基，将培养周期分为20、25、30、40 d 4个不同时间周期，每处理转接5～6瓶，以芽苗枯死率为试验指标，观察不同的培养周期对芽苗枯死率的影响。

芽苗枯死率（%）=枯死的芽苗个数/接种数×100%

1.3 数据处理

采用Exce1和DPS统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 培养基筛选

组织培养中，培养基的筛选很重要。本试验在参照以往沙棘组织培养基筛选实验，分别选用了WPM、1/2MS、1/4MS 3种浓度的基本培养基［9］，不添加任何植物生长调节物质，蔗糖浓度为20%，20 d后观察西藏沙棘茎尖生长状况，试验结果见表1。

表1 基本培养基对西藏沙棘茎尖苗高生长统计表

从表1中可以看出，1/2MS 培养基中沙棘茎尖生长健壮，芽色嫩绿，茎尖高均值最大，为2.82 cm；1/4MS培养基沙棘茎尖生长状态一般；WPM培养基中沙棘茎尖长势最差。1/2MS 培养基中沙棘茎尖高均值与1/4MS培养基沙棘茎尖高均值达到了5%显著水平，但与WPM培养基沙棘茎尖高均值达到了极显著差异。由此可见，西藏沙棘茎尖组织培养过程中，1/2MS为较适宜的基本培养基。

对茎尖高生长均值进行新复极差法分析，见表2。从表2中可以看出，不同的培养基对茎尖生长的F值等于101.407，对应的相同概率值P=0.000 1＜0.01，说明不同培养基对苗高有极显著差异。

表2 基本培养基对西藏沙棘茎尖生长方差分析表

2.2 不同浓度 6-BA与NAA的不同组合对西藏沙棘茎尖高生长的影响

茎尖经过一段时间的生长必须要转接到新的培养基中才能更好地继续生长，在增殖过程中，合适的生长调节物质及其组合，可以大大提高芽的增殖数量，扩大繁殖系数［10］。分析不同浓度6-BA与NAA的不同组合对西藏沙棘茎尖高生长的影响，并进行方差分析和多重比较，结果见表3～表6。

表3 不同浓度的6-BA与NAA组合对西藏沙棘茎尖高生长的影响

表4 不同浓度6-BA与NAA组合对西藏沙棘茎尖高生长的方差分析

表5 不同浓度6-BA对西藏沙棘茎尖高生长的多重比较

表6 不同浓度NAA对西藏沙棘茎尖高生长的多重比较

从表4中方差分析结果可以看出，不同浓度的6-BA、NAA对西藏沙棘茎尖增殖影响差异极显著，说明6-BA与NAA配合有交互作用。

用新复极差法进行进一步多重比较表明，F值等于11.129 0，对应的相同的概率值P=0.038 36＜0.05的显著水平，极差法测验结果表明，A1pha0.05（24）=0.210 4，A因素概率值 4.650 0，B因素概率值5.666 7，A×B均方差4.733 3大于临界值0.210 4。因此得出：6-BA的适宜浓度为1.0 mg/L；NAA的适合浓度为0～0.1 mg/L；两因素进行交互分析得出1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA为茎尖生长调节剂的最佳组合。

2.3 蔗糖浓度对西藏沙棘茎尖高生长的影响

从表7可以看出，蔗糖浓度为2.0 mg/L时，苗高均值最大，为7.3 cm。经多重比较得出，蔗糖浓度为2.0 mg/L时与其他3个蔗糖浓度存在极显著差异，由此可见，2.0 mg/L的蔗糖浓度对苗高的生长最为适宜。

表7 不同蔗糖浓度对西藏沙棘茎尖高生长的影响

对苗高均值进一步进行方差分析（表8），可以看出，不同的蔗糖浓度对苗高生长的F值等于28.330对应的相同的概率值为P=0.000 4＜0.01，说明不同浓度的蔗糖对苗高生长有极显著差异。

表8 不同蔗糖浓度对西藏沙棘茎尖高生长均值方差分析

2.4 转接周期对克服芽苗枯死现象的影响

在西藏沙棘组织培养的整个过程中，不断出现芽苗逐渐变褐、干枯、继而死亡的现象。为了尽可能避免这一现象的发生，试验以1/4MS为基本培养基，将外植体的转接周期分为15 d、20 d、25 d、30 d，统计芽苗枯死状况，试验结果见表9。

表9 培养周期对西藏沙棘芽苗枯死率的影响

从表9可以看出，转接周期为15 d时，芽苗枯死率最低，为16.33%，与其他转接周期相比，存在极显著性差异。用Duncan新复极差法对转接周期对西藏沙棘芽苗枯死率进行方差分析（见表10），结果表明，不同的培养周期对芽苗枯死率的F值343.412 0对应的P=0.000 1＜0.01，存在极显著性差异，由此可见，缩短转接周期，加快转接频率有助于改善芽苗的生长状况，能够在一定程度上克服芽苗的枯死现象。

表10 西藏沙棘芽苗枯死状况方差分析表

3 结论与讨论

3.1 结论

西藏沙棘茎尖生长最适宜的基本培养基1/2 MS；茎尖生长中生长调节剂6-BA与生长素NAA浓度配比最佳组合为：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；当培养基中蔗糖浓度为2.0 mg/L时西藏沙棘茎尖生长高均值最大，达到2.82 cm； 茎尖的转接周期为15 d时，芽苗枯死率最低；转接周期超过30 d时，芽苗枯死率最高，达到52.67%。

3.2 讨论

沙棘组织快繁技术已经很成熟，运用也很广泛，但对于青海省野生西藏沙棘组织培养技术研究国内外尚未见报道，西藏沙棘的组织培养技术还在摸索阶段，还有大量的工作要做。

西藏沙棘作为高寒地区经济树种之一，虽然资源丰富，资源品质优良，但野生资源引种开发难度大。因此在西藏沙棘组织培养中外植体的选取显得至关重要，不同时间取材对外植体的诱导效果不同。从各种研究中可以看出，沙棘组织培养中外植体的取材时间最好选择在萌动和发育早期［10］。在适当的时期选择适当的外植体，才能培养出更好的幼苗，从而进行大规模繁育，在西藏沙棘茎尖的组织培养过程中，消毒和灭菌环节也很重要，它们是组织培养中的重要环节［11］，关系到芽苗的正常生长。

［1］吴琼，孙坤，张辉，等.山西省中国沙棘天然居群表型多样性研究［J］.西北师范大学学报：自然科学版，2007，43（3）：78-84.

［2］贺窑青，冯改霞，贺小青，等.林木组织培养的应用与研究［J］.河南林业科技，2003，23（1）：27-30.

［3］徐虹，梁宗锁.沙棘组织培养技术的研究［J］.西北植物学报，2001，21（2）：267-272.

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［5］KASchestibratov，RVMikhailov，SVDolgov.Plantlet regeneration from subculturable nodular callus of Pinus radiata ［J］ .Plant Cell Tissue&Organ Culture，2003，72（2）：139-146.

［6］DR Bastola，P Agrawal.In vitro Propagation of a Himalayan pine P. wallichiana A.B.Jacks［J］. Current Science. 2000.

［7］RE Percy，K Klimaszewska，DR Cyr.Evaluation of somatic embryogenesis for clonal propagation of western white pine. Canadian Journal of Forest Research ［J］. 2011，30（12）：1667-1876.

［8］孙兰英.沙棘组织培养与植株再生研究［J］.国际沙棘研究与开发，2004，2（2）：28-30.

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［10］杨丽萍，张虎林，赵秀梅.沙棘离体快速繁育技术研究［J］.国际沙棘研究与开发，2004，（1）：12-16.

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（责任编辑：杨婷婷）

Preliminary Study on Rapid Propagation Techniques with on stem-tip tissue Hippophae thibetana

SONG Weixiu，ANG Maoji，PENG Maozhuoma
（College of Agriculture&Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016，Qinghai，China）

In this paper young and tender stem tips were used as explants to study tissue culture techniques for growing seedlings of Hippophae thibetana.The results showed that the optimal basic culture medium is 1/2 MS；the optimal growth regulator concentration ratio for Hippophae thibetana stem tips growth is 6-BA1.0mg.L-l+NAA0.lmg.L-l；The mean stem-tip height increment reached maximum of 2.82 cm with sucrose concentration of 2.0mg.L-1；In the stem-tip proliferation process，appropriate switching cycles could lessen dieback of bud seedlings；The dieback rate reached minimum of 16.33%with the replanting interval of 15d and increased significantly to 52.67%when the replanting interval extended to 30 d.

Hippophae thibetana；Stem tips；Explants；Rapid propagation with tissue culture techniques

S793.6

A

2095-0152（2016）03-0023-04

2016-03-16

2016-04-26

青海大学中青年基金项目“青海省野生西藏沙棘生物化学特性及组织快繁技术研究”（编号：2012-QNY-Z）。

宋维秀（1973-），女，副教授，主要从事林木种苗理论与技术研究。E-mail：songweixiu2003@sina.com