水稻黄绿叶突变体ygl-63的特征和基因定位

张亮行， 张帆涛,2*， 聂　丽， 万令飞，梁剑秋， 张雨佳， 马羊帅， 谢建坤

( 1. 江西师范大学 生命科学学院， 南昌 330022； 2. 江西师范大学 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室， 南昌 330022 )



水稻黄绿叶突变体ygl-63的特征和基因定位

张亮行1， 张帆涛1,2*， 聂丽1， 万令飞1，梁剑秋1， 张雨佳1， 马羊帅1， 谢建坤1

( 1. 江西师范大学 生命科学学院， 南昌 330022； 2. 江西师范大学 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室， 南昌 330022 )

叶绿体的正常发育对于植物至关重要，突变体研究是探明叶绿体发育过程中基因功能的有效途径。叶色突变体已引起人们广泛的关注，通过对各种植物材料的研究，叶色突变的分子机制已取得一定进展，但远未被阐明，尤其在水稻当中。目前，已报道的水稻叶色突变体，主要表现为黄化、白化、亮绿、条斑条纹、温敏变色、转绿和转紫等。该研究使用甲基磺酸乙酯(EMS)处理粳稻日本晴，获得一份遗传稳定的突变体ygl-63，其整个生育期叶片均表现为黄绿色。通过测定ygl-63和野生型苗期叶片的叶绿素含量发现，ygl-63中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量与野生型相比分别下降了31.9%、42.2%和34.1%，同时叶绿素a/b值较野生型增加。这表明叶绿素含量的降低是导致ygl-63黄绿叶突变性状的主要原因，并且叶绿素b的降幅大于叶绿素a。在成熟后调查主要农艺性状发现ygl-63单株有效穗数和结实率分别减少8.9%和8.5%；千粒重增加10.4%；而株高，穗长和每穗着粒数和野生型相比差异并不显著。通过测量微量元素发现，ygl-63种子中的铁和锌含量较野生型显著降低，分别减少85.7%和64.8%。将ygl-63与正常绿色品种明恢63杂交获得F1和F2群体，进行遗传分析发现，ygl-63突变性状受1对隐性基因控制，通过基因定位，将该基因定位到水稻第11染色体长臂的分子标记InDel-3和InDel-5之间约2.4 cM范围内。该基因被认为是一个新的水稻叶色突变基因，暂命名为ygl-63(g)。所得结果为今后对ygl-63(g)基因的进一步研究奠定了基础。

水稻, 叶色突变体, 甲基磺酸乙酯, 微量营养元素, 分子标记, 遗传分析, 基因定位

光合作用是绿色植物利用叶绿素等光合色素，在可见光的照射下，将二氧化碳和水转化为有机物，并释放出氧气的生化过程(Leister et al, 2003)。叶片是植物进行光合作用的主要器官，其中的叶绿体不仅参与了重要的光合作用，将光能转化为化学能，同时，叶绿体还参与了植物体内的各种代谢产物的合成途径(黄晓群等，2007; 程欣等，2013)。突变体在植物的生理、生化和功能基因组研究等方面具有重要作用(杨松涛等，2010; 张霞等，2012)。迄今为止，在许多高等植物中都发现了叶色相关突变体，如水稻(胡忠等，1981)、大豆(Ghirardi et al, 1988)、大麦(Krol et al, 1995)、小麦(Falbel et al, 1996)、玉米(Greene et al, 1998)和拟南芥(Carol et al, 1999)等。叶色突变不仅影响植物的光合作用，而且会破坏植物正常的生长发育，甚至导致植株死亡(Jung et al, 2003; Nakanishi et al, 2005; Zhang et al, 2006)。

以拟南芥为模式植物，叶色调控机制的研究已取得重要进展，其合成叶绿素b所需酶的编码基因都已被克隆(Nagata et al, 2005; Beale et al, 2005)。水稻作为重要的粮食作物和单子叶模式植物，许多叶色基因相继被报道，但是迄今为止，只有其中少数基因被克隆，水稻叶色调控的分子机理还远未被阐明(李育红等，2011)。OsPPR1是一个水稻叶绿体发育相关的基因，该基因表达水平的降低可引起水稻叶片发生白化(Gothandam et al, 2005)；OsCAO1和OsCAO2基因编码水稻叶绿素酸酯α加氧酶，OsCAO1受光诱导，而OsCAO2则在黑暗条件下起作用(Lee et al, 2005)；OsChlD和OsChlI基因分别编码ChlD和ChlI亚基，它们是水稻失绿突变体Chlorina-1和Chlorina-9的突变相关基因(Zhang et al, 2006)；YGL1基因位于水稻第5染色体上，负责编码水稻叶绿素合酶(Wu et al, 2007)；RNRLI和RNRSl

图 1　ygl-63和野生型亲本在分蘖期的表型(A)与种子的比较(B)Fig. 1　Plant phenotype of the ygl-63 and the wild type at tillering stage (A) and comparison of the mature grains (B)

基因分别编码水稻叶绿体发育必需的核苷酸还原酶的大亚基和小亚基(Yoo et al, 2009)；OsDVR基因编码水稻联乙烯还原酶，该酶可以催化水稻中联乙烯叶绿素a转化为单乙烯叶绿素a(Wang et al, 2010)。本研究通过EMS诱变获得了一份水稻黄绿叶突变体，暂命名为ygl-63，其整个生育期叶片均呈现黄绿色。与野生型亲本相比，ygl-63的单株有效穗数和结实率显著减少，千粒重显著增加，种子中的铁和锌元素含量较野生型显著降低。此外，通过构建遗传群体，对突变体进行了遗传分析和基因定位，为进一步图位克隆突变基因奠定了基础。

1　材料与方法

1.1 材料及田间试验

用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理日本晴(粳稻)，获得一份黄绿叶突变体，连续进行多代自交后发现突变体性状不发生分离，表明该突变体遗传稳定，暂命名为ygl-63。以日本晴为野生型对照。将ygl-63与正常绿叶籼稻品种明恢63杂交，分别播种F1和F2群体，用于遗传分析和基因定位。

1.2 叶绿素含量的测定

于苗期取突变体ygl-63和野生型亲本相同部位的叶片，分别进行叶绿素a和叶绿素b含量的测定，并计算叶绿素总含量及叶绿素a和叶绿素b的比值(Chl a/b)，测定方法参照Lichtenthaler(1987)。

1.3 微量营养元素铁和锌含量的测定

将突变体ygl-63和野生型亲本的种子自然风干后，委托农业部稻米及制品质量监督检验测试中心测定种子中铁和锌元素的含量。

1.4 基因池的构建、定位群体和总DNA的提取

以突变体ygl-63与明恢63杂交获得F2群体。从群体中分别选取20株正常植株和20株突变植株构建正常基因池和突变基因池，并利用群体中的166株突变植株进行基因定位。DNA提取方法参照McCouch et al(1998)。

1.5 分子标记和遗传图谱的构建

简单序列重复标记(SSR)来自Gramene数据库(http://www.gramene.org/microsat/)。运用Primer 3 (v. 0.4.0)(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)在线软件设计插入缺失标记(InDel)。PCR反应总体系及PCR程序参照Panaud et al(1996)进行，将扩增产物电泳和成像后记录结果。所得数据用Mapmaker 3.0作图软件进行连锁分析，并使用Kosambi函数将重组率进行转化，获得遗传距离(厘摩，cM)，进而构建分子标记连锁图谱。

2　结果与分析

2.1 ygl-63的特征与主要农艺性状

相比野生型，突变体ygl-63植株的整个生育期均表现为黄绿叶表型。同时，突变体ygl-63的单株有效穗数和结实率分别减少8.9%和8.5%，千粒重增加10.4%，达到差异极显著水平(P<0.05)。而株高、穗长和每穗着粒数等农艺性状在突变体ygl-63和野生型亲本之间差异不显著(图 1，表 1)。

表 1　ygl-63和野生型的农艺性状

注： *P=0.05差异显著。 下同。

Note: * Significantly different atP= 0.05. The same below.

2.2 ygl-63叶绿素含量分析

经测定，突变体ygl-63中总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b含量与野生型亲本相比分别减少34.1%、31.9%和42.2%，叶绿素a/b值较野生型亲本增加17.6%，均达到差异极显著水平(P<0.05)(表2)。表2结果表明，叶绿素含量减少是导致ygl-63黄绿叶突变性状的主要原因，并且ygl-63中叶绿素b含量的降幅较叶绿素a更大。

表 2　ygl-63和野生型的叶绿素含量

2.3 微量营养元素的含量分析

通过测定野生型亲本和突变体ygl-63种子中铁和锌微量元素的含量，发现突变体ygl-63种子中的铁和锌元素含量分别为2.32和13.7 mg·kg-1，均明显低于野生型亲本种子中的铁(16.26 mg·kg-1)和锌(38.9 mg·kg-1)的含量，分别减少85.7%和64.8%，达到差异极显著水平(P<0.05)(表 3)。

表 3　ygl-63和野生型谷粒中铁和锌的含量

2.4 ygl-63的遗传分析

2.5 ygl-63(g)的分子标记定位

在水稻12条染色体上，选取230对较均匀分布的SSR引物扩增定位群体的双亲DNA，筛选出具有多态性的引物，然后用这些引物扩增正常基因池和突变基因池，结果发现引物RM2110和RM4601在两池之间表现有明显差异，推测两引物可能与ygl-63(g)基因位点相连锁。随后利用F2群体中的20株正常叶色植株和20株突变叶色植株进行验证，证明了两引物确与ygl-63(g)位点有连锁关系。利用定位群体将ygl-63(g)基因定位在水稻第11号染色体引物RM2110和RM4601之间约12.0 cM的范围内。随后在两引物之间进一步的设计合成更多的分子标记，将ygl-63(g)基因最终定位在引物InDel-3 (F: TGCTTTCATCAAGATTGTGC, R: GGGGTAC-TGCTTGACTGCTC)和InDel-5 (F: CCACGCGATGA-TGTTAAGGT, R: GCAGCACAGTTTGCATTAGC)之间约2.4 cM的范围内，遗传距离分别约为0.9 cM和1.5 cM(图 2)。

图 2　ygl-63(g)基因在第11染色体长臂上基因定位Fig. 2　Gene mapping of ygl-63(g) on the long arm of chromosome 11

3　讨论与结论

本研究中，我们利用化学诱变剂EMS诱变粳稻品种日本晴，获得了一份遗传稳定的水稻突变体ygl-63，该突变体在全生育期均表现出黄绿叶的突变表型。目前所发现的大多数水稻叶色调控基因在使得叶色发生变化的同时也会引起其他性状的改变。例如水稻黄绿叶突变体D83，该突变体与野生型相比，成熟期每穗着粒数和千粒重分别减少9.45%和10.76%(李秀兰等，2010)；水稻黄绿叶突变体507ys，与野生型相比，突变体507ys在成熟期株高、每穗着粒数、每株有效穗数和结实率分别减少8.3%、7.4%、51.0%和11.6%(李燕群等，2014)；水稻黄绿叶突变体ygl10，与野生型相比，突变体ygl10在成熟期株高、穗长和结实率均发生了显著的降低或减少(杨海莲等，2014)。同样，突变体ygl-63除叶色变异外，还伴随有单株有效穗数和结实率显著降低，而千粒重显著增加的变异性状。单株有效穗数、结实率和千粒重是决定水稻产量的关键因素，对ygl-63进一步的研究将有利于探明水稻产量调控机理，其结果对于增加水稻产量具有重要的理论意义。

此外，我们通过测定微量营养元素，发现突变体ygl-63种子中的铁和锌元素含量较野生型亲本显著降低，分别减少85.7%和64.8%。铁和锌作为人体必需的微量营养元素，对人们的身体健康极为重要(郑建仙等，1999)。缺铁性贫血和缺锌可引发营养不良、免疫功能下降、生长发育迟缓和智力降低等一系列疾病，已对我国的国民健康和社会发展构成了巨大威胁，缓解铁锌等微量营养元素缺乏所带来的危害迫在眉睫(何一哲等，2012)。补充铁锌等微量营养元素，最好采取食补(韩龙植等，2003)。水稻作为我国重要的粮食作物，全国有近三分之二的人口以稻米为主食，对其进行品质改良，尤其是提高稻米中微量营养元素的含量，是当今水稻育种的一项重要任务(孙明茂等，2006)。对于突变体ygl-63的进一步研究将有助于理解水稻种子微量营养元素含量的调控机理，为改良水稻品质奠定理论基础。

通过构建分离群体，我们将突变基因ygl-63(g)定位在水稻第11染色体，位于标记InDel-3和InDel-5之间，遗传距离约为2.4 cM。目前，在同一条染色体共有6个叶色相关基因被定位，即V9(Satoh et al, 1984)，tsc1(Dong et al, 2001)，OsPPR1(Gothandam et al, 2005)，Z1(张道允等, 2008)，Z2(Chai et al, 2011)和yl11(刘朝辉等, 2012)。其中，V9突变体在幼苗期表现出几乎纯白色，在移栽后叶片表现为浅绿色和白色叶脉；tsc1突变体是一个温敏叶色突变体，苗期低温时表现叶绿素缺失，高温时正常绿色；OsPPR1突变体表现出叶片白化，并伴随有致死表型；Z1、Z2突变体均表现出斑马叶表型；yl11突变体的苗期呈现出淡黄色表型，从分蘖期开始叶片的黄色逐渐加深，到达成熟期时叶片呈现出完全黄色的表型。可见，ygl-63与这些叶色突变体的表型性状有很大差异，是一个新型的水稻叶绿素缺失突变体。同时，从定位结果分析，ygl-63(g)基因被定位在水稻第11染色体长臂分子标记InDel-3和InDel-5之间，与同一染色体的叶色基因不在同一范围内，说明ygl-63(g)基因是一个新的水稻叶色突变基因。今后我们将在已有基础上扩大定位群体，在初定位区间发展新的分子标记，精细定位、克隆ygl-63(g)基因，并进一步对该基因的功能进行研究。

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Characteristics and gene mapping of yellowish green leaf mutantygl-63 in rice (OryzasativaL.)

ZHANG Liang-Xing1， ZHANG Fan-Tao1,2*， NIE Li1， WAN Ling-Fei1，LIANG Jian-Qiu1， ZHANG Yu-Jia1， MA Yang-Shuai1， XIE Jian-Kun1

( 1.CollegeofLifeSciences，JiangxiNormalUniversity， Nanchang 330022， China； 2.KeyLaboratoryofProtectionandUtilizationofSubtropicPlantResourcesofJiangxiProvince,JiangxiNormalUniversity， Nanchang 330022， China )

Chloroplasts are important organelles in green plants for photosynthesis, and normal development of chloroplasts is important to plants. Mutant analysis is a useful approach to illuminate the function of gene in complex biological process of chloroplast development. Nowadays, extensive attention has been paid to the leaf-color mutation, and certain achievements have been made by studying various organisms, but the mechanism of mutation and the responsible loci have not been fully understood at molecular level, especially in rice. Up to now, many leaf-color mutants were reported in rice, mainly featured by etiolation, albino, brilliant green, stripe, temperature sensitive allochromasia, turning green and purple in leaf color. In this study, a rice yellowish green leaf mutantygl-63 was identified, which derived from Nipponbare (Oryzasativassp.japonica) treated by ethyl methanesulfonate (EMS). The mutantygl-63 exhibited distinct yellowish green leaf trait throughout the growth period. To characterize the yellowish green leaf phenotype of theygl-63 mutant, we measured its chlorophyll contents at the seedling stage. Compared to that of its wild-type parent Nipponbare, the content of chlorophyll (Chl) a, Chl b and total chlorophyll decreased significantly in the mutantygl-63, with 31.9%, 42.2% and 34.1% respectively, indicating that the mutant phenotype ofygl-63 was resulted from reduced chlorophyll level. In addition, the ratio of Chl a/b was increased, due likely to the potential of Chl b synthesis in suffering a more severe decline than Chl a in theygl-63 mutant; and at maturity, the number of productive panicles per plant and seed setting rate reduced by 8.9% and 8.5%, respectively; the 1 000-grain weight increased by 10.4%; but the plant height, panicle length and the number of spikelets per panicle were not affected remarkably with its wild-type parent Nipponbare. Meanwhile, by measuring the contents of micronutrients, we found that the Fe and Zn contents in the seeds ofygl-63 mutant were significantly reduced by 85.7% and 64.8% respectively, compared with its wild-type parent Nipponbare. Genetic analysis of F1and F2generations ofygl-63 mutant crossed with the normal green variety Minghui 63 (Oryzasativassp.indica) showed that the mutant trait ofygl-63 was controlled by a single recessive nuclear gene. Genetic mapping of the mutant gene was conducted by using SSR and InDel molecular markers and 166 F2plants from the cross ofygl-63 with the normal green variety Minghui 63, and the mutant gene ofygl-63 was finally mapped on the long arm of rice chromosome 11. The genetic distances from the target gene to the markers InDel-3 and InDel-5 were 0.9 and 1.5 cM, respectively. The geneygl-63 was considered to be a new rice yellowish green leaf mutant and its mutant gene was tentatively named asygl-63(g). These results will provide the information for the cloning and functional analysis ofygl-63(g) gene in the future.

rice, leaf color mutant, ethyl methanesulfonate, micronutrients, molecular marker, genetic analysis, gene mapping

10.11931/guihaia.gxzw201411029张亮行， 张帆涛， 聂丽， 等. 水稻黄绿叶突变体ygl-63的特征和基因定位 [J]. 广西植物， 2016， 36(8):891-896

ZHANG LX， ZHANG FT， NIE L， et al. Characteristics and gene mapping of yellowish green leaf mutantygl-63 in rice (OryzasativaL.) [J]. Guihaia， 2016， 36(8):891-896

2014-11-23

2015-03-31

国家自然科学基金(31201191，31660386)； 江西省自然科学基金(20132BAB214009，20142BAB204012)； 江西省教育厅项目(GJJ14248)； 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室开放基金(YRD201403) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31201191，31660386)；Natural Science Foundation of Jiangxi (20132BAB214009，20142BAB204012)； Jiangxi Program of Education Office (GJJ14248)； Open Fund of Jiangxi Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources (YRD201403)]。

张亮行(1986-)，男，硕士研究生，主要从事水稻分子生物学研究，(E-mail)121084760@qq.com。

张帆涛，博士，硕士生导师，研究方向为水稻遗传育种与分子生物学，(E-mail)zhang84004@163.com。

Q945.45

A

1000-3142(2016)08-0891-06