蜂蜜中氨基酸应用研究进展

孙政，程妮, 2，曹炜, 2*

1(西北大学 分析科学研究所, 陕西 西安,710069) 2(西北大学 化工学院食品科学与工程系/蜂产品应用技术研究中心, 陕西 西安,710069)



蜂蜜中氨基酸应用研究进展

孙政1，程妮1, 2，曹炜1, 2*

1(西北大学 分析科学研究所, 陕西 西安,710069) 2(西北大学 化工学院食品科学与工程系/蜂产品应用技术研究中心, 陕西 西安,710069)

氨基酸是蜂蜜中一类重要的化合物，其含量受花源地的影响很大，已作为蜂蜜中的一种特征物质广泛地应用于花源、掺假鉴别等方面。文中简述了氨基酸在蜂蜜掺假、花源鉴别中的应用，贮藏过程中的变化规律，及蜂蜜中氨基酸的检测方法。

蜂蜜；氨基酸；掺假；花源鉴别；检测方法

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜汁液或依附在植物上昆虫的分泌物，经充分酿制，贮存在蜂巢中的甜性物质[1]。蜂蜜不仅含有丰富的营养成分，而且具有抑菌、抗氧化、抗炎、保护化学性肝脏损伤及抗癌等活性，临床上广泛用于治疗烫烧伤、儿童上呼吸道感染引起的咳嗽等疾病[2]。蜂蜜在许多国家被列为一种重要的民间药，我国也将蜂蜜定为药食两用的物质。

氨基酸是蛋白质的基本组成单元，是人体所必需的一种物质，也是食品营养价值评价的重要指标。研究发现，蜂蜜中游离氨基酸的种类和含量因花源、地域和气候的不同而有差异，蜂蜜中的氨基酸可用于鉴别蜂蜜的种类和产地，也可以作为一种鉴别蜂蜜掺假的有效方法[3]，尤其在鉴别蜂蜜的花源方面比其他化合物具有一定优势。本文对氨基酸在蜂蜜掺假、花源鉴别、贮藏过程中的变化规律以及蜂蜜中氨基酸的检测方法进行了综述。

1　蜂蜜中氨基酸

氨基酸是一种自然界广泛存在的小分子化合物，结构上包含氨基和羧基。氨基酸可以分为蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸两大类。当体内缺乏蛋白质氨基酸时，会导致组织器官代谢紊乱，引发一系列的相关疾病。非蛋白质氨基酸虽然在自然界含量极少，且不参与构成机体组织器官，但已有研究证明非蛋白质氨基酸有抗癌、抗菌、护肝等功能[4]。

游离氨基酸约占蜂蜜总量的1%左右，包括20种蛋白质氨基酸以及部分非蛋白质氨基酸[5]。目前研究较多的是蛋白质氨基酸，包括赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸8种必需氨基酸和甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸12种非必需氨基酸。其中绝大多数蜂蜜中脯氨酸占总游离氨基酸量的50%以上，刘小力[6]研究了蜂蜜中17种蛋白质氨基酸发现，必需氨基酸占游离氨基酸总量的40%左右。REBANE等人[7]通过质谱定性检测出爱沙尼亚多花种蜂蜜中的23种游离氨基酸，除蛋白质氨基酸外，还包括β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和鸟氨酸3种非蛋白质氨基酸。β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和鸟氨酸也是研究较多的3种非蛋白质氨基酸，MARA等人[8]也通过高效液相色谱法研究了蜂蜜中包括这3种非蛋白质氨基酸在内的23种游离氨基酸，并发现西班牙中心地区的蜂蜜中不含α-氨基丁酸、蛋氨酸和甲硫氨酸。

由文献中的很多氨基酸色谱图可以看出，蜂蜜中还含有大量未知非蛋白质氨基酸，应用质谱或核磁共振技术探明这些氨基酸的种类，对研究蜂蜜的营养价值和生物功能有很重要的意义。除此之外，氨基酸作为蜂蜜中的一种特异性成分，在确定蜂蜜花源地和鉴别掺假方面有广泛的用途。

2　氨基酸在蜂蜜花源鉴别中的应用

蜂蜜可以根据其蜜源植物进行分类，不同花源的蜂蜜在口感、营养价值和市场价格上都有很大的不同。我国有近100种蜜源植物，蜂蜜种类繁多，研究鉴别蜂蜜花源的方法很有必要。

蜂蜜中氨基酸的主要来源是蜜源植物的花粉、花蜜及蜜蜂自身的分泌物，其种类和含量受蜜源植物影响，也与地理环境与气候等有关。因此，游离氨基酸可以作为蜂蜜的花源标识物。

REBANE等[7]研究了产自爱沙尼亚的石楠花蜜、薄荷蜜、椴树蜜、油菜蜜、柳树蜜、蔷薇蜜、百花蜜等7种蜂蜜中的氨基酸组成及其含量，发现甲硫氨酸和半胱氨酸可以用于鉴别爱沙尼亚蜂蜜，因为爱沙尼亚蜂蜜均不含这2种氨基酸；脯氨酸和苯丙氨酸是爱沙尼亚蜂蜜中的主要氨基酸；通过t-检验法发现，α-丙氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和色氨酸可以作为爱沙尼亚蜂蜜的花源标识物；鸟氨酸可用来鉴别薄荷蜜；谷氨酸可用来鉴别油菜蜜；脯氨酸、精氨酸和苯丙氨酸可以用来鉴别石楠花蜜。PABLO[9]等人分析了产自阿根廷科尔瓦多东南区、西北区和布宜诺斯艾利斯西北区3个地区56个蜂蜜样品中的17种氨基酸含量，发现不同地区的氨基酸在含量上有显著差异，如科尔瓦多东南区和布宜诺斯艾利斯西北区的蜂蜜中丝氨酸、精氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的含量差异较大；通过聚类分析法将56种蜂蜜样品分为9类，运用主成分分析法对这9类样品氨基酸数据进行分析，并结合采集地区花源植物进行对应分析。得出影响蜂蜜中氨基酸含量的主要因素是花源植物。IGLESIAS[10]等人研究了46种蜂蜜中的23种氨基酸，发现氨基酸也可以用于鉴别由花蜜酿制的蜂蜜和甘露蜜。其中甘露蜜中的总氨基酸量最高，花蜜酿制的蜂蜜中的总氨基酸含量最少。组氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸的含量在甘露蜜和蜂蜜中没有显著差异，蜂蜜中苯丙氨酸和色氨酸的含量大于甘露蜜，甘露蜜中的其他氨基酸的含量却高于蜂蜜[11]。

充分研究蜂蜜中氨基酸的种类和含量，对确定蜂蜜来源有重大的意义。构建不同蜂蜜的氨基酸指纹图谱，并结合蜂蜜中其他物质的分析，运用化学计量学方法，可以显著提高蜂蜜花源地鉴别的准确率。

3　氨基酸在蜂蜜掺假鉴别中的应用

蜂蜜是一种绿色、营养、健康的保健食品，在国内外均有广泛的销售市场，但随市场需求的扩大，掺假现象也日益严重，已经严重扰乱了蜂蜜的市场秩序，损害了中国蜂蜜在广大消费者心中的形象。建立一种准确，高效的方法来判断蜂蜜掺假，意义重大。

蜂蜜的主要掺假形式有2种，一种是糖浆掺假，尤其是果葡萄糖浆；另一种是以次充好，将廉价的蜂蜜掺入到高价蜂蜜中。目前鉴别蜂蜜真伪的方法有很多种，包括蜂蜜的色值、可挥发性物质、花粉种类以及其他一些花源标识物[12]。但还没有一种方法可以从根本上解决蜂蜜掺假鉴别问题，还需要对蜂蜜中更多的特异性成分进行分析，以完善鉴别蜂蜜真伪的技术。蜂蜜中的游离氨基酸已被证明是可以确定蜂蜜花源地的标识物，根据其差异可以确定蜂蜜的掺假。

果葡萄糖浆中不含氨基酸，因而检测蜂蜜中的氨基酸有可能作为鉴别蜂蜜中是否掺入果葡萄浆的有效方法。吴黎明[13]等人测定了蜂蜜和果葡萄糖浆中脯氨酸的含量后发现，蜂蜜中氨基酸的量随果葡萄糖的掺入量的增加呈线性减小趋势，由此建立了一种基于测定脯氨酸含量鉴别蜂蜜掺假的有效方法。COTTE[14]等人分析了真蜂蜜、商品蜂蜜和掺杂糖浆的蜂蜜的样品，并通过主成分分析法分析了3种蜂蜜中的氨基酸，通过比较其差别，成功鉴别了掺有10%～15%糖浆的蜂蜜样品。HAMIDE[15]等人研究了土耳其9种蜂蜜70个样品的掺假情况，通过将蜂蜜中糖类物质、挥发性物质、物理常数等数据和氨基酸数据相结合，进行主成分分析和判别分析，发现将氨基酸数据和其他理化数据相结合，可以更准确的鉴别蜂蜜的种类，从而判断是否掺假。

不同蜂蜜中氨基酸的差异，能够在一定程度上起到鉴别蜂蜜真伪的作用，然而蜂蜜中氨基酸成分复杂多变，用于鉴别蜂蜜真伪的精确度不高。但将氨基酸数据与其他成分数据和部分理化指标相结合组成数字矩阵，应用化学计量学方法，可以大幅提高蜂蜜掺假鉴别的准确性。

4　氨基酸在蜂蜜贮藏过程中的变化

蜂蜜中所含的成分复杂，各成分在储藏过程中会受外界温度、湿度、储藏时间以及蜂蜜内其他物质的影响而使其含量发生变化。如蜂蜜中的酚类物质会随时间而逐渐氧化，使其含量减低；酶蛋白也会与蜂蜜中的蛋白质发生反应使蛋白质含量发生变化[16]。蜂蜜中的氨基酸也会因加工储藏过程中的外部条件，以及和蜂蜜中其他物质反应而使含量发生变化。

IGLEIAS等人[10]研究了蜂蜜中不同种类氨基酸在储存过程中的变化，发现氨基酸有4种变化趋势。由于美拉德反应，总氨基酸和大部分氨基酸的含量在前9个月减少的趋势较为显著。天冬氨酸、β-丙氨酸和脯氨酸在开始几个月含量有所上升，6个月时含量达到最高，6个月后脯氨酸开始减少，12个月后天冬氨酸含量开始减少；β-丙氨酸在6个月后变化变化不大，这一方面是由于这些氨基酸的美德拉反应较为缓慢，另一方面是因为脯氨酸和天冬氨酸是花粉蛋白的主要成分，开始几个月在蜂蜜中蛋白酶的作用下发生分解。鸟氨酸的变化趋势与其他氨基酸都不同，它在开始几个月含量减少，12个月后开始逐渐上升到接近初始量，这是由美德拉反应、酶分解微生物以及精氨酸降解的共同作用导致的。

影响蜂蜜中氨基酸含量的因素有以下几方面：(1) 蜂蜜中的氨基酸发生美德拉反应，使氨基酸含量减少，这也是氨基酸含量发生变化的主要原因。蜂蜜中主要成分为葡萄糖和果糖，二者均为美拉德反应的底物，在酸性、加热条件下，氨基酸极易与还原糖发生美拉德反应，从而导致蜂蜜颜色加深、氨基酸含量下降，甚至产生羟甲基糠醛等有害化合物；(2) 蜂蜜中某些蛋白质在蛋白酶的作用下分解，生成氨基酸，使蜂蜜中某些游离氨基酸含量上升；(3) 未灭菌的蜂蜜中含有一些微生物，在酶的作用下生成氨基酸；(4) 氨基酸自身分解，生成其他氨基酸[17-20]。

因蜂蜜中游离氨基酸的多变性，会影响其作为花源标识物用于掺假鉴别的准确性，但这一情况在蜂蜜的其他特异性物质中也存在，如酚酸、蛋白质等。蜂蜜中氨基酸的变化与其他物质不同，并非仅有下降一种趋势，研究真蜂蜜和掺假蜂蜜中氨基酸随时间的变化趋势，可以成为一种新的鉴别掺假的方法，也可以用于解释掺假和花源地鉴别中出现的错误。总之，了解氨基酸含量随时间的变化，可以为氨基酸在做蜂蜜的花源标识物、鉴别蜂蜜掺假等方面提供参考。

5　蜂蜜中氨基酸的检测方法

随着近年来大型仪器的发展，氨基酸检测方法越来越多，常用方法包括：茚三酮比色法法、气相色谱、柱前和柱后反相高效液相色谱法、离子交换色谱、毛细管电泳和色谱质谱连用等[21-25]。

因除几个有苯环的氨基酸外，大部分氨基酸都无紫外吸收，因而不能用紫外可见检测器测定其含量，所以在检测前要对其进行衍生化。柱前反相高效液相色谱法是近年来用于研究蜂蜜中氨基酸较多的一种方法，这种方法灵敏度高、选择性好、分析速度快、精密度高、自动化程度高而且可供选择的衍生剂种类多等优点[26]。常用的衍生剂有邻苯二甲醛(OPA)、丹磺酰氯(DANS-Cl)、9-芴甲基氯甲酸酯(9-FMOC)、异硫氰酸苯脂(PTIC)、乙氧甲叉丙二酸二乙脂(DEEMM)、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基酸基甲酸酯(AQC)等[27-29]。GONZLEZ等人采用OPA柱前衍生，高效液相色谱荧光检测方法，实现了蜂蜜和蜂花粉中23种氨基酸的分离和定量分析[24]，但OPA衍生剂只能与一级氨基酸反应，且氨基酸衍生物的不稳定，且要尽快测定；Pablo等采用PTIC衍生，反相高效液相色谱法，测定了阿根廷56种蜂蜜的氨基酸色谱图[17]，此方法生成的衍生物稳定，无副产物干扰，但耗时较长，需要专门的真空蒸发装置而且PITC毒性大；REBANE等人采用DEEMM衍生，高效液相色谱串联质谱技术，测定了蜂蜜中的23种氨基酸的含量，该方法可以有可见光进行检测，但反应时间较长，不易控制[29]；除此之外AQC的应用也很广泛，AQC氨基酸的衍生过程简单、衍生物稳定、无副产物干扰，但价格较贵、衍生剂易氧化。

在选择反相高效液相色谱法测定蜂蜜中氨基酸的种类和含量，要根据样品和实验条件，选择合适的衍生剂对样品进行衍生化，以得到最优的结果。

6　小结

我国是蜂蜜生产大国，具有生产优质蜂蜜的花源和地源条件，但市场上蜂蜜的质量参差不齐，掺假现象十分严重，对我国蜂蜜产业造成了很大的影响。随着科技的发展和技术的革新，对蜂蜜中的各种微量成分的研究也越来越便捷，使通过一些特殊微量物质来标记蜂蜜的花源地成为了现实。

选择氨基酸作为一种蜂蜜的花源标识物，是目前研究蜂蜜花源地和掺假的一个重要发展方向。通过比较不同蜂蜜中氨基酸种类和含量的区别，结合其他理化数据，应用化学计量学方法分析，建立氨基酸指纹图谱，为蜂蜜的质量控制、真伪鉴别和蜂蜜溯源提供一种可靠的方法。虽然，仅依靠氨基酸含量很难准确确定蜂蜜的种类及其掺假情况，但随着新仪器和新方法的不断出现，利用氨基酸含量一定可以更准确提供有关蜂蜜花源以及掺假鉴别的信息。

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A review of applications of amino acids in honey

SUN Zheng1, CHENG Ni1, 2, CAO Wei1, 2*

1(Institute of Analytical Science, Northwest University, Xi’an 710069, China) 2(Research Centre of Bee Product/Department of Food Science and Engineering, College of Chemical Engineering, Northwest University, Xi’an 710069, China)

Amino acids are the main compounds in honey, and greatly influenced by the local flowers. They are used as an important internal standard substance in identifying honey adulteration. This paper reviewed the application of amino acids in honey adulteration , flower source identification. The changes of amino acids in honey storage and their analytical methods were discussed and hope this will provide reference for the traceability and quality control of monofloral honey in our country.

honey; amino acid; adulteration; floral markers; analytical method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601046

硕士研究生(曹炜教授为通讯作者,E-mail：caowei@nwu.edu.cn)。

国家自然科学基金项目(31272510); 西安市农业技术研发项目(NC1405(1))

2015-06-06，改回日期：2015-07-07