刺梨中SOD的提取和酶活测定

付安妮，高明波, 冯　杰

(大连民族大学生命科学学院, 辽宁　大连　116600 )



刺梨中SOD的提取和酶活测定

付安妮，高明波, 冯杰

(大连民族大学生命科学学院, 辽宁大连116600 )

刺梨原产于我国西南地区，以贵州省为主，是目前发现超氧化物歧化酶(SOD)含量最高的水果[1]。本实验采用邻苯三酚自氧化法，分别测定刺梨鲜果、糖渍刺梨、刺梨干冲泡的饮品和刺梨酒中的SOD酶活。实验结果表明，刺梨鲜果和糖渍刺梨的SOD酶活分别为2140 U/g和3716.2 U/g；刺梨干冲泡的饮品、刺梨酒的SOD酶活分别是308.2 U/mL、368.1 U/mL。经比较发现，刺梨果实用糖腌制后SOD活性提高1.7倍左右，而制成饮品后SOD的酶活变化不大。

刺梨；超氧化物歧化酶；邻苯三酚自氧化法；糖渍法

SOD(Super Oxide Dismutase)即是超氧化物歧化酶。它能专一地清除体内的有害自由基。氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都是由其中的氧自由基引起的，而SOD 能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因，是生物体内重要的抗氧化酶。

刺梨是蔷薇属的野生灌木植物，具有增强机体免疫力、延缓衰老、抗癌等功能[1-2]。刺梨果实中含有丰富的超氧化物歧化酶(SOD)、维生素、微量元素、五环三萜、黄酮、有机酸、氨基酸和无机盐等化学成分。最值得注意的是：刺梨是目前发现的SOD含量最高的水果，至今未被超越[1]。与其它果蔬SOD含量的对比如表1所示[3]。

但是这一绿色资源至今仍广泛地被埋没于于山区中，没有得到很好的开发利用，一个主要原因是刺梨产期较短(只有30天左右)，不耐贮藏。目前人们常用以下三种保藏方式：晒干、酿酒和糖腌制。获得的刺梨干果(泡茶饮用)、刺梨酒和糖渍刺梨可以长期保存，全年食用。所以本实验，将刺梨按如上方法处理，检测刺梨干冲泡饮品、刺梨酒和糖渍刺梨的SOD酶活，并分析比较三种保藏方式对酶活的影响，提出关于刺梨食用方式的一些建议。

表1　刺梨与常见果蔬的SOD含量对比

1　实　验

1.1材料与试剂

刺梨鲜果：2015年9月于贵州当地市场购买的野生刺梨鲜果；挑选出体型较大、肉刺分布均匀、较硬的果实若干，用去离子水清洗备用。

1 U/5 μL标准SOD液: SOD标准品(5673 U/mg)购于中国药品生物制品检定所；取1.6 mg SOD标准品定容至45.384 mL去离子水中，4 ℃冰箱中备用。

其他试剂为分析纯，购买于科密欧化学公司。

1.2主要仪器

UV-5200紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；S10H中药超声萃取仪，Elma-Hans；ABS 80-4电子分析天平，KERN & Sohn GmbH；FZ102型微型植物试样粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干箱，昆山市超声波仪器有限公司；H-2050R台式高速冷冻离心，长沙湘仪离心机有限公司。

1.3刺梨SOD提取和检测方法

1.3.1SOD的提取方法

1.3.1.1果肉中SOD的提取

刺梨鲜果处理：取适量果实切片后备用。

糖渍刺梨处理：刺梨鲜果切片，置于玻璃器皿内均匀铺开，按m刺梨:m白砂糖=1:2的比例撒上白砂糖，密封后静置一个礼拜。

SOD提取：取适量刺梨鲜果/糖渍刺梨于A4纸上均匀铺开，置电热恒温鼓风干燥箱中，55 ℃[4-5]干燥2 h，之后用高速万能粉碎机粉碎，分别称量20 g待用。按1:4的比例加入磷酸缓冲液80 mL，置于中药超声萃取仪中，4 ℃超声30 min[6]，之后在4 ℃条件下，10000 r/min离心20 min，得到的上清液即为SOD粗酶液，测量并记录粗酶液的体积，于4 ℃冰箱中保藏备用。

1.3.1.2饮品的获取

刺梨酒：刺梨鲜果切片，于蒸锅内加热5 min左右，放入密封罐内，并加入56度白酒加以浸泡，密封罐子并静置。现有两种家酿刺梨酒，分别编号为A(浸泡开始后未做任何处理，成品酒呈深棕色)和B(浸泡过程中多次加水，导致成品酒呈浅棕色)。浸泡时间均为1年左右。

刺梨干冲泡饮品：取三片晒干刺梨切片，置于250 mL玻璃杯中，加入200 mL左右沸水，沸水从无色变成棕色后即可饮用。

分别取5 mL的刺梨酒A/B及冲泡饮品备用。

1.3.2SOD酶活检测方法

邻苯三酚(PR)自氧化法是目前应用最广泛的测试方法。所用试剂和仪器普通，测试方便且灵敏度高[7]。通过制备标准SOD终浓度对邻苯三酚(PR)自氧化抑制率的回归方程，再测得刺梨样液对PR的抑制率，根据标准回归方程及样液的稀释倍数计算出刺梨样品SOD的活力。根据文献确定实验条件为：系统PR浓度 60 mmol/L[7]；系统pH=8.2±0.01；孵育温度25 ℃下测量320 nm吸光光度值。

此外刺梨富含黄酮类化合物，该类化合物在紫外区有强吸收，会干扰邻苯三酚法对SOD活性的测定结果，故在测定每一浓度的试液的吸光度时均需加测本底吸收值，以校正测定结果。本底值即用10 mmol/L HCL代替PR进行检测，得到的吸光度值。相关公式如下：

(1)

(2)

(3)

式中：A0——PR自氧化至4 min时反应液在320 nm处的吸收值

As——SOD标准品抑制PR自氧化至4 min时反应液在320 nm处吸收值

Aa——刺梨SOD样液抑制PR自氧化至4 min 时反应液在320 nm处的吸收值

Ab——刺梨SOD样液在320 nm处的本底吸收值

Y——标准方程计算出的样品在反应样液中的 SOD的浓度，U/mL

4——反应样液总体积，mL

V0——刺梨样品SOD提取液体积，mL

VS——测定用SOD提取液体积，μL

m——刺梨样品质量，g

1.3.2.1PR自氧化速率

于试管中加入4 mL缓冲液，25 ℃保温10 min，加入同样温度孵育的PR 20 μL，快速摇匀后立即计时。以Tris-HCl缓冲液为空白对照，于320 nm波长下每1分钟测一次吸光度，共计6 min。计算线性范围内每分钟吸光度A的增值，得到PR自氧化速率ΔA=0.06(A/min)。

1.3.2.2绘制标准曲线

编号1～6的试管中均加入4 mL缓冲液，再分别加入5、10、15、20、25、30 μL的1 U/5 μL SOD标准溶液，25 ℃水浴保温10 min后分别加入同样温度孵育的PR 20 μL，快速摇匀后立即计时，记录4 min时混合溶液在320 nm处的吸收值，按公式(1)计算抑制率，得到标准方程，做出回归曲线。

1.3.2.3刺梨果肉及饮品的SOD活性测定

用刺梨鲜果/糖渍刺梨提取液及刺梨酒A/B及冲泡饮品替代SOD标准液重复上述实验步骤，并加测本底吸收值，以排除黄酮类物质的干扰。根据数据尽量调整其抑制率接近50%，按公式(3)计算样品SOD活性，在样品SOD活性的测定中严格以SOD标准试剂加以对照。

2　结　果

2.1自氧化速率

实验测量320 nm下反应液吸光度，计算得到PR自氧化速率为0.60，结果如表2所示。

表2　邻苯三酚(PR)自氧化速率

2.2标准方程

取4 min时PR测得的吸光度0.296代入公式(2)，算出标准SOD对邻苯三酚的抑制率，以SOD终浓度值(U/mL)作为横坐标，抑制率(%)作为纵坐标制得标准方程Y=24.7490X+5.2252，结果如表3所示。

表3　标准SOD终浓度与PR自氧化抑制率之间的关系

2.3回归曲线

以SOD标准品浓度为横坐标，SOD标准品对PR的抑制率为纵坐标，作出回归曲线，结果如图1所示。

图1　标准SOD浓度与PR自氧化抑制率间的回归曲线

2.4刺梨果肉及饮品SOD检测结果

测得刺梨鲜果样品在320 nm下的吸光度，并代入公式(3)计算出反应液的抑制率，结果如表4所示。

表4　刺梨鲜果SOD提取液测量结果

取抑制率最为接近50%的第四组数据，加入刺梨样液20 μL时抑制率为58.11%，根据标准方程算出刺梨鲜果样液的SOD浓度为2.14 U/mL，代入公式(3)算出刺梨SOD酶活为2140 U/g。采用相同的方法，测量糖渍刺梨果肉中的SOD酶活，结果为3716.2 U/g。

针对饮品类刺梨SOD提取液，以U/mL为统一的酶活计量单位，计算出剩下刺梨制品的SOD酶活，结果如表5所示。

表5　刺梨酶活

3　讨　论

通过对实验结果的整理分析发现，采用白砂糖腌制的方法可以提高刺梨果肉中的SOD酶活，提高到1.7倍左右。同时，还能延长果肉的保存时间。

刺梨饮品中，刺梨酒和干果冲泡饮品的SOD酶活变化不大，刺梨酒酶活仅提高了17.4%。可见冲泡的方式对酶活的影响不大，两种方式皆可使用。

本次实验中，还加测了一组刺梨酒B，制作者在浸泡过程中曾多次取出部分刺梨酒饮用，其后又加入近似体积的水。试验测得这组样品的SOD酶活为80.4 U/mL，对PR的抑制率为20%。比较发现酒B的SOD酶活仅为酒A的1/5，因此不建议在刺梨酒酿造过程中加水稀释，会大大降低SOD的酶活。

建议：选择刺梨果肉部分食用时，建议采用糖渍的方式腌制，处理后果肉的SOD酶活明显提高，而且保存时间长，可全年食用。同时糖渍法简单快捷，腌制时间短，所以十分推荐此方法。而刺梨饮品中，SOD酶活变化不大，且两种方式保存时间也很接近，根据喜好选择即可。

刺梨多为野生，成本低，其产品符合现代食品营养保健及绿色有机的要求，建议进一步开发利用。

[1]黎放. 抗癌珍果“SOD刺梨”[J]. 技术与市场, 2010, 17(5):125-125.

[2]何照范,熊绿芸,吴立夫.剌梨——其营养、防癌与抗衰老作用[J].生命的化学:中国生物化学会通讯, 1988(3):51-52.

[3]史肖白,顾姻,庄一义,等. 刺梨超氧化物歧化酶含量的分析研究[A]. 中国园艺学会.中国园艺学会成立70周年纪念优秀论文选编[C].中国园艺学会,1999:4.

[4]李兰, 郭丹钊, 孟庆阳. 刺梨细胞中SOD的几种提取方法研究[J]. 食品工业科技, 2006(2):71-73.

[5]魏瑞锋, 魏桃英. 猕猴桃中SOD提取工艺研究[J]. 安徽农业科学, 2013(32):12716-12717.

[6]王振伟, 许镭. 超声波辅助提取刺梨中SOD的工艺研究[J]. 黄河水利职业技术学院学报, 2015, 27(1):46-49.

[7]韩少华,朱靖博,王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造, 2009(6):155-157.

[8]宋金耀.超氧化物歧化酶-邻苯三酚自氧化测活方法的改进[J].河北农业技术师范学院学报,1992,6(2):30-35.

[9]吴素玲,张卫明,孙晓明,等. 刺梨SOD活力测定研究[J]. 食品科学, 2005,26(11):58-62.

Extraction and Activity Determination of SOD in Rosa roxburghii Tratt

FU An-ni, GAO Ming-bo, FENG Jie

(College of Life Science, Dalian Nationalities University, Liaoning Dalian 116600, China)

RosaroxburghiiTrattis a kind of fruit native to southwest of China, mainly in Guizhou province. Its super oxide dismutase (SOD) content is the highest among fruits. Pyrogallol autoxidation method was used to determine the SOD activity of fresh fruits and candied fruits, drinks and wine. The results showed that the SOD activity of fresh fruits and candied fruits were 2140 U/g and 3716.2 U/g, respectively. The SOD activity of drinks and wine were 308.2 U/mL and 368.1 U/mL, respectively. It could be found that the SOD activity of the sugared fruits was 1.7 times that of the fresh fruits, while the SOD activity of the drinks and wine were similar.

RosaroxburghiiTratt；SOD(Super Oxide Dismutase)；Pyrogallol autoxidation method；sugaring treatment

付安妮(1993-)，女，大连民族大学生命科学学院。

高明波(1974-)，女，副教授，主要从事药用植物方面的研究。

Q946.5

A

1001-9677(2016)016-0144-03