单次大剂量阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者血管内皮功能及Rho激酶活性的影响

谢莲娜，王丽君，王凯君，魏显敬，解泽宙

单次大剂量阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者血管内皮功能及Rho激酶活性的影响

谢莲娜，王丽君，王凯君，魏显敬，解泽宙

目的：通过观察单次大剂量阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者血管内皮功能及外周血白细胞Rho激酶活性的影响，探讨他汀改善不稳定性心绞痛患者血管内皮功能的可能机制。

方法：入选2012-08至2014-02入住我院的不稳定性心绞痛患者78例，入院当日给予阿托伐他汀80 mg一次顿服。分别于服药前及服药后12 h以超声测反应性充血前后肱动脉内径（FMD）的变化，以免疫印迹法（Western Blot）测外周血白细胞肌球蛋白轻链磷酸酶的肌球蛋白结合亚单位（MYPT1）及在Thr853位上磷酸化的MYPT1（p-MYPT1Thr853）蛋白表达，以p-MYPT1Thr853占总MYPT1的百分比表示Rho激酶的活性。

结果：患者服用阿托伐他汀80 mg 12 h后，FMD较治疗前增加28.15% ［（6.50±1.68）% vs （8.33±1.93）%，P＜0.001］，外周血白细胞Rho激酶活性较治疗前降低32.78% ［（58.91±5.22）%vs （39.6±3.85）%，P=0.002］。

结论：大剂量阿托伐他汀能快速改善不稳定性心绞痛患者的血管内皮功能，RhoA/Rho激酶通路抑制参与他汀类药物快速改善血管内皮功能的作用。

阿托伐他汀；内皮，血管；Rho激酶；心绞痛，不稳定型

Abstract

Objective:To explore the possible mechanism of statins improving endothelial function via observing the effect of a high single dose atorvastatin on endothelial dysfunction and peripheral blood leucocyte Rho kinase activity in patients with unstable angina （UA）.

Methods:A total of 78 consecutive UA patients admitted in our hospital from 2012-08 to 2014-02 were enrolled. The patients received a single dose of atorvastatin 80 mg on the day of admission. Flow-mediated vasodilation （FMD） of brachial artery was examined by high-resolution ultrasound at before and 12 hours after medication. Protein expression of phospho-specific Thr853-MYPT1 （p-MYPT1Thr853） and MYPT1 was measured by Western blot analysis； peripheral blood leukocyte Rho kinase activity was assayed by the proportion of phospho-Thr853 in myosin binding subunit of light chain phosphatase （MYPT1）.

Results:Compared to prior medication，with atorvastatin 80 mg for 12 hours，FMD was increased 28.15% as （6.50 ±1.68） % vs （8.33 ± 1.93） %，P＜0.001 and peripheral blood leucocyte Rho kinase activity was decreased 32.78% as （58.91 ± 5.22） % vs （39.6 ± 3.85 ） %，P=0.002.

Conclusion:High dose atorvastatin could rapidly improve vascular endothelial dysfunction in UA patients. inhibiting of RhoA/Rho kinase pathway may involve in the effect of statins improving endothelial function.

（Chinese Circulation Journal，2016，31:746.）

他汀类药物是临床中广泛使用的抗动脉粥样硬化基础用药。强效降低低密度脂蛋白胆固醇是他汀类药物临床获益的基础。他汀类药物通过抑制3-羟3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶的活性，在抑制胆固醇合成的同时减少类异戊二烯介质的生成、抑制细胞内RhoA/Rho激酶信号转导通路的活性［1］。RhoA/Rho激酶信号转导通路激活所致的血管内皮功能障碍在不稳定性心绞痛发病中具有重要的作用。本研究通过观察单次大剂量阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者血管内皮功能及外周血白细胞Rho激酶活性的影响，探讨他汀改善不稳定性心绞痛患者血管内皮功能的可能机制。

1　资料与方法

研究对象：入选2012-08至2014-02入住我院的不稳定性心绞痛患者78例。不稳定性心绞痛包括：初发劳累心绞痛、恶化劳累心绞痛、静息心绞痛。排除标准：既往对他汀类药物不耐受、有肝脏疾病史、有肌肉疾病史、肾功能不全、2周内使用他汀类药物。

试验步骤：符合入选条件的患者入院当日在填写知情同意书后，一次性服阿托伐他汀80 mg。在服药前及服药12 h后分别取静脉血20 ml，进行白细胞分离，用于测定Rho激酶活性；同时于服药前及服药12 h后进行非创伤性血管内皮功能检查。入院次日空腹取静脉血进行常规生化检测包括：肝功能、肾功能、血糖、血脂等。

非创伤性血管内皮功能检查：以反应性充血前后肱动脉内径（FMD）的变化反映内皮依赖性血管舒张功能。应用飞利浦 SONOS 5500彩色超声显像仪（Agilent 科技公司，美国），分别测量患者休息时、反应性充血后肱动脉内径。受试者测试前休息10 min，在测定肱动脉内径基础值（D0）后进行反应性充血试验：将血压计袖带置于肘上，冲气加压至250 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），4min后迅速将袖带放气减压，放气后60～90 s内在同一部位测肱动脉的内径（D1）。FMD=（D1-D0）/D0×100%。

白细胞分离：静脉血20 ml加入EDTA-K+抗凝管，水平式离心机200 g离心20 min，用微量移液器吸取血浆，加入红细胞裂解液，用水平式离心机800～1200 g离心30 min，弃上清，沉淀即为白细胞，-80℃保存，批量检测Rho激酶活性。

Rho激酶活性测定：Rho激酶激活后在Thr853位上磷酸化肌球蛋白轻链磷酸酶的肌球蛋白结合亚单位（MYPT1）使肌球蛋白轻链磷酸酶失活。应用免疫印迹法（Western Blot）测定不稳定性心绞痛患者外周血白细胞MYPT1蛋白及在Thr853位上磷酸化的MYPT-1（p-MYPT1Thr853）蛋白表达，以MYPT1磷酸化程度（p-MYPT1Thr853占总MYPT1的百分比）表示Rho激酶的活性。白细胞裂解后，高速离心，上清蛋白定量。取20 μg蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，用水浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜（Millipore，美国），进行免疫印迹反应。一抗：兔抗人多克隆MYPT1抗体（1：500，Santa Cruz，美国），兔抗人多克隆p-MYPT1Thr853抗体 （1：500，Santa Cruz，美国）。二抗：山羊抗兔 IgG （1：4000，福州迈新）。增强化学发光（ECL）显色、显影、定影。将显色条带胶片扫描至计算机中，应用Quantity One凝胶定量软件（Bio-Rad，美国）对目的电泳条带进行分析，测目的条带的积分光密度值，记录结果。计算MYPT1磷酸化程度：p-MYPT1Thr853积分光密度/总MYPT1积分光密度×100%（p-MYPT1Thr853/ MYPT1×100%）。

统计学处理：用SPSS 16.0统计分析软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。治疗前后各参数比较用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

患者一般临床资料：78例患者平均年龄（64.97±10.67）岁，男53例，女25例，陈旧性心肌梗死5例，既往冠状动脉介入治疗7例。患者的血浆平均甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平依次为（1.86±1.09）mmol/L、 （4.93±1.17）mmol/L、（3.08±1.15）mmol/L和（1.12±0.26）mmol/L。其他冠心病相关危险因素分布情况及心血管药物使用情况见表1。

表1　78例患者冠心病相关危险因素及临床用药情况

单次大剂量他汀对不稳定性心绞痛患者血管内皮功能的影响：应用超声检测比较患者入院时及服用80 mg 阿托伐他汀12 h后FMD。该组不稳定性心绞痛患者入院时FMD为（6.50±1.68） %，服用阿托伐他汀80 mg 12 h后FMD为（8.33 ±1.93）%，较入院时增加28.15%（P＜0.001）。

单次大剂量他汀对不稳定性心绞痛患者外周血白细胞Rho激酶活性的影响（图1）：应用免疫印迹法测定患者入院时及服用80 mg阿托伐他汀 12 h后外周血白细胞MYPT1及p-MYPT1Thr853蛋白表达，计算并比较Rho激酶活性。入院时患者外周血白细胞Rho激酶活性为（58.91±5.22）%，服用阿托伐他汀80 mg 12 h后外周血白细胞Rho激酶活性为（39.6±3.85）%，较入院时降低32.78%（P=0.002）。

图1　免疫印迹法分析不稳定性心绞痛患者服用阿托伐他汀前后外周血白细胞中p-MYPT1Thr853和MYPT1蛋白水平（Rho激酶活性）

3　讨论

血管内皮功能障碍是急性冠状动脉综合征包括不稳定性心绞痛的重要发病机制之一。基础及临床研究充分证实，他汀类药物具有改善血管内皮功能的作用。早期临床研究证实，单剂量他汀能快速改善健康受试者及稳定性冠心病患者血管内皮功能。Omori等［2］给予胆固醇水平正常的健康受试者口服单剂量西立伐他汀，结果发现，应用西立伐他汀3 h 后FMD明显增加。Wassmann等［3］给予稳定性心绞痛患者普伐他汀40 mg一次口服，于用药前及用药24 h后观察乙酰胆碱诱发的冠状动脉痉挛，结果显示，应用40 mg普伐他汀24 h后乙酰胆碱诱发的冠状动脉痉挛明显改善。近期Kono等［4］的研究显示，单剂量匹伐他汀能在2 h内改善冠状动脉疾病患者的外周微血管功能。

基于以上研究，本研究观察一次口服阿托伐他汀80 mg对不稳定性心绞痛患者血管内皮功能的影响，结果显示，不稳定性心绞痛患者一次口服80 mg阿托伐他汀12 h后FMD增加28.15%，提示单次大剂量阿托伐他汀具有快速改善不稳定性心绞痛患者血管内皮功能的作用。血管内皮功能障碍是急性冠状动脉综合征包括不稳定性心绞痛发生心血管事件及心血管死亡的重要机制，入院后即刻给予大剂量阿托伐他汀能快速改善血管内皮功能，有助于改善不稳定性心绞痛患者的临床预后。

近年来，国内外研究者对他汀降脂以外的作用机制进行了深入的探讨，证实RhoA/Rho激酶信号转导通路广泛参与了他汀类药物的降脂外作用［5］。RhoA是小G蛋白超家族中的一个亚族，广泛分布于哺乳动物的组织细胞中。胆固醇合成中的中间产物类异戊二烯介质是RhoA激活的必要物质基础。这些类异戊二烯介质与RhoA的C末端相连，增加RhoA的亲脂性 （异戊烯化），促使其定位在细胞膜上而激活。Rho激酶是160 kDa的蛋白丝氨酸/酪氨酸激酶，是RhoA的主要效应蛋白。RhoA激活后通过激活Rho激酶发挥其重要生理功能。他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶，在抑制胆固醇合成的同时，减少类异戊二烯介质的生成，抑制RhoA的异戊烯化，进而抑制Rho激酶的活性［1］。有关他汀类药物抑制Rho激酶活性的作用已在基础研究方面获得充分的验证。RhoA/Rho激酶信号转导通路是一氧化氮合酶（eNOS）表达及激活的重要调节机制。体外研究证实［6］，他汀通过抑制RhoA/Rho激酶信号转导通路活性上调eNOS表达，增强eNOS活性。既往临床研究证实，应用他汀4周能使动脉粥样硬化患者外周血白细胞Rho激酶的活性降低40%～53%，同时明显改善内皮依赖性血管舒张功能［7，8］。但应用他汀4周的结论并不能用于解释短期负荷他汀所带来的临床获益［9］。ARMYDA-RECAPTURE研究证实，在冠状动脉介入术前12 h负荷80 mg阿托伐他汀能明显减少冠状动脉介入术后30 d主要心血管事件［10］。基于此，本研究观察阿托伐他汀80 mg 一次口服对不稳定性心绞痛患者外周血白细胞Rho激酶活性的影响，结果显示，不稳定性心绞痛患者一次口服阿托伐他汀80 mg 12 h后外周血白细胞Rho激酶活性较治疗前降低32.78%，提示大剂量他汀能快速抑制不稳定性心绞痛患者Rho激酶的活性。Wolfrum等［11］通过人大隐静脉内皮细胞培养发现，Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔能在15 min内激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K/ Akt）信号转导通路，使一氧化氮（NO） 释放增加4倍。综合上述研究结果，推测抑制RhoA/Rho激酶信号转导通路活性是单次大剂量阿托伐他汀快速改善不稳定性心绞痛患者血管内皮功能的重要机制。

此外，阿托伐他汀能快速改善血管内皮功能可能部分是源于其脂溶性特征。由于细胞膜由双层脂质组成，他汀的细胞内作用效果在脂溶性他汀和水溶性他汀之间是不同的。Jantzen等［12］研究显示，糖尿病患者脂溶性他汀西立伐他汀在12 h内增加eNOS表达的作用强于水溶性他汀瑞舒伐他汀。因此阿托伐他汀能快速进入血管壁、抑制血管内皮细胞Rho激酶活性、增加NO的生物利用度是其快速改善血管内皮功能的机制之一。

本文局限性：外周血白细胞Rho激酶活性只是间接反映血管组织Rho激酶活性。

综上所述，我们认为，大剂量阿托伐他汀能快速改善不稳定性心绞痛患者的血管内皮功能，RhoA/ Rho激酶通路抑制参与他汀类药物快速改善血管内皮功能的作用。

［1］Liao JK. Isoprenoids as mediators of the biological effects of statins. J Clin Invest，2002，110： 285-288.

［2］Omori H，Nagashima H，Tsurumi Y，et al. Direct in vivo evidence of a vascular statin： a single dose of cerivastatin rapidly increases vascular endothelial responsiveness in healthy normocholesterolaemic subjects. Br J Clin Pharmacol，2002，54： 395-399.

［3］Wassmann S，Faul A，Hennen B，et al. Rapid effect of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibition on coronary endothelial function. Circ Res，2003，93： e98-e103.

［4］Kono Y，Fukuda S，Shimada K，et al. Very rapid effect of pitavastatin on microvascular function in comparison to rosuvastatin：reactive hyperemia peripheral arterial tonometric study. Drug Des Devel Ther，2013，7： 369-374.

［5］李建军. 他汀类药物非调脂作用及其机制. 中国循环杂志，2011，26： 233-235.

［6］Laufs U，La Fata V，Plutzky J，et al. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors. Circulation，1998，97： 1129-1135.

［7］Liu B，Zhang JY，Cao HM，et al. Effect of rosuvastatin on ROCK activity，endothelial function，and inflammation in Asian patients with atherosclerosis. Intern Med，2012，51： 1177-1182.

［8］Nohria A，Prsic A，Liu PY，et al. Statins inhibit Rho kinase activity in patients with atherosclerosis. Atherosclerosis，2009，205： 517-521.

［9］刘洋，李浪，苏强，等. 强化阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者冠状动脉介入治疗术后CD4+ T淋巴细胞微小核糖核酸-21表达的影响. 中国循环杂志，2014，29： 26-30.

［10］Di Sciascio G，Patti G，Pasceri V，et al. Efficacy of atorvastatin reload in patients on chronic statin therapy undergoing percutaneous coronary intervention： results of the ARMYDA-RECAPTURE （Atorvastatin for Reduction of Myocardial Damage During Angioplasty） randomized trial. J Am Coll Cardiol，2009，54： 558-565.

［11］Wolfrum S，Dendorfer A，Rikitake Y，et al. Inhibition of Rho-kinase leads to rapid activation of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase Akt and cardiovascular protection. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24： 1842-1847.

［12］Jantzen F，Konemann S，Wolff B，et al. Isoprenoid depletion by statins antagonizes cytokine-induced down-regulation of endothelial nitric oxide expression and increases NO synthase activity in human umbilical vein endothelial cells. J Physiol Pharmacol，2007，58： 503-514.

Effect of a High Single Dose Atorvastatin on Endothelial Function and Rho Kinase Activity in Patients With Unstable Angina

XIE Lian-na，WANG Li-jun，WANG Kai-jun，WEI Xian-jing，XIE Ze-zhou.
Department of Cardiology，Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian （116001），Liaoning，China
Corresponding Author: XIE Lian-na，Email: xieln1963@163.com

Atorvastatin； Endothelial function； Rho kinase； Unstable angina

2015-11-21）

（编辑：朱柳媛）

2011年大连市医学卫生科学技术研究项目

116001辽宁省大连市，大连大学附属中山医院循环科

谢莲娜主任医师博士主要专业方向：心血管疾病临床诊治、冠心病介入治疗、冠脉痉挛机制探讨Email： xieln1963@163.com通讯作者：谢莲娜

R541.4

A

1000-3614（2016）08-0746-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.08.005