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HPLC-PAD法同时测定复方黄柏液涂剂中9种成分的含量

2016-09-25王玉团许丽丽徐丽华

中国现代中药 2016年12期
关键词:小檗黄柏连翘

王玉团,许丽丽,徐丽华

(山东省食品药品检验研究院,山东 济南 250101)

HPLC-PAD法同时测定复方黄柏液涂剂中9种成分的含量

王玉团*,许丽丽,徐丽华

(山东省食品药品检验研究院,山东 济南 250101)

目的:建立同时测定复方黄柏液涂剂中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱和连翘苷含量的方法。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.5%磷酸为流动相(梯度洗脱),流速为1.0 mL·min-1;柱温为25 ℃;PAD检测器。结果:9种成分含量测定的线性关系良好,线性范围和相关系数分别为12.37~185.55(r=0.999 9)、38.80~582.06(r=1.000 0)、15.90~238.50(r=0.999 9)、1.52~22.86(r=0.999 8)、48.26~723.87(r=1.000 0)、5.90~88.56(r=0.999 3)、6.58~98.64(r=1.000 0)、9.79~119.58(r=0.999 9)、16.91~253.71 μg·mL-1(r=0.999 9);平均加样回收率分别为98.63%、102.57%、101.31%、97.95%、102.59%、98.41%、97.59%、98.77%、101.31%;方法的精密度良好,RSD均小于2.0%(n=6)。结论:该方法准确,可靠,可用于复方黄柏液涂剂的质量控制。

高效液相色谱法-二级管阵列检测器;复方黄柏液涂剂;含量测定

复方黄柏液涂剂主要由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和地龙五味药组成。主要作用是清热解毒、消肿祛腐。用于疮疡溃后伤口感染,属阳证者。是临床应用较广泛的治疗皮肤溃疡等疾病的外用制剂。现行标准收载于2015年版《中华人民共和国药典》一部,仅收载盐酸小檗碱和连翘苷两种成分的含量测定[1]。经研究发现,制剂中还含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C等成分,以上成分均具有较强的抗菌药理作用,特别是所含绿原酸类成分普遍认为具有很好的抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、军团菌等细菌的作用,其抗菌机制可能与非竞争性抑制细菌体内的芳基胺乙酰转移酶有关[2-5]。研究还发现,连翘苷抑菌作用并不是很强,而连翘酯苷则有明显的抗炎、解热、抗内毒素、抗菌和抗病毒等作用,故有必要对制剂中连翘酯苷A进行质量控制[6-8]。本文对复方黄柏液涂剂中9种成分进行含量测定,旨在为复方黄柏液涂剂的质量评价提供参考,有利于进一步提高复方黄柏液涂剂的质量控制水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪;Waters 2448 PAD检测器;METTLER AE240电子天平;超声波清洗仪(苏州富怡达公司)。

1.2 试药

连翘苷(中国食品药品检定研究院,批号:110821-201514,含量以93.5%计);盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院,批号:110713-201212,含量以86.7%计);绿原酸(中国食品药品检定研究院,批号:110753-200413);连翘酯苷A(中国食品药品检定研究院,批号:111810-201001,含量以94.3%计);新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C(成都普思生物科技有限公司,含量≥98%,批号分别为ps010603-05,ps010512-05,ps08103102,ps08110401);盐酸黄柏碱(四川维克奇生物科技公司,批号20100410,含量>98%);复方黄柏液涂剂(山东汉方制药有限公司);甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参考相关文献[9-11],采用如下色谱条件,色谱柱:Agilent extend C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B),梯度洗脱,0~15 min,5%~25%A,15~70 min,25%~35%A,70~80 min,35%~45%A;流速:1 mL·min-1;柱温:25 ℃;PAD检测器(波长范围190~450 nm)。在此色谱条件下各色谱峰峰形较好,与相邻峰的分离度均大于1.5,符合含量测定要求,理论板数以新绿原酸峰计为6878。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱测定波长为325 nm,连翘苷测定波长为228 nm,分别进样量10 μL,色谱图见图1。

注:A.混和对照品(325 nm);B.混和对照品(228 nm);C.供试品(325 nm);D.供试品(228 nm);1.新绿原酸;2.绿原酸;3.隐绿原酸;4.盐酸黄柏碱;5.连翘酯苷A;6.异绿原酸B;7.异绿原酸C;8.盐酸小檗碱;9.连翘苷。图1 复方黄柏液涂剂HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

配制一定浓度的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱和连翘苷对照品甲醇储备液,精密量取对照储备液各1 mL,置50 mL棕色量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,制成质量浓度分别为61.85、194.02、79.05、7.62、241.29、29.52、32.88、39.86、84.57 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品5 mL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇4 mL,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)5 min,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,即得。

2.4 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20、30 μL,注入高效液相色谱仪测定。以对照品浓度X(μg·mL-1)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程,结果见表1。

表1 9种成分的回归方程,相关系数和线性范围

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL,按照2.1项下色谱条件,重复进样6次,记录峰面积,9种成分峰面积的RSD分别为1.2%、0.8%、0.2%、0.7%、0.6%、0.2%、1.1%、0.8%、1.0%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 μL,按照2.1项下色谱条件,分别于0、2、4、8、12、24 h进样,记录峰面积,9种成分峰面积的RSD在0.2%~1.8%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密量取复方黄柏液涂剂6份,每份5 mL,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件,进行测定。结果9种成分含量的RSD在0.2%~2.1%,表明样品的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的复方黄柏液涂剂样品6份(样2,新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、盐酸黄柏碱、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸C、盐酸小檗碱和连翘苷9种成分质量浓度分别为123、388、158、15.2、482、58.5、65.2、79.5、169 μg·mL-1),每份2.5 mL,各精密加入混合对照品溶液5 mL,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)5 min,按照2.3项下方法制备供试品溶液,进样10 μL,进行测定,计算平均回收率,结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

表2(续)

2.9 样品的含量测定

按2.3项下方法制备供试品溶液,并按照2.1项下色谱条件进行测定。9种成分的平均含量见表3。

表3 9种成分的含量测定结果 /μg·mL-1

3 讨论

3.1 检测波长的选择

新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B和异绿原酸C在324~327 nm内有最大吸收,连翘酯苷A在328 nm附近有最大吸收,盐酸小檗碱在264 nm附近有最大吸收,盐酸黄柏碱在284 nm附近有最大吸收,以上8种成分均在325 nm处具有很强的吸收,与杂质能够完全分离,为简化实验过程,故以上8种成分含量测定波长选择为325 nm。连翘苷在波长325 nm处无吸收,其最大吸收波长为228 nm,与杂质能够完全分离,故选择228 nm作为连翘苷的含量测定波长。同时测定以上9种成分,仅需要提取两个波长下的色谱图就可以实现,且基线更加稳定,优于不同时间切换不同测定波长方法。

3.2 化学成分探索

在本实验色谱条件下,在盐酸黄柏碱和连翘酯苷A色谱峰之间,存在两个较大的色谱峰,经进一步探索,主要来自处方中连翘,具体成分未知。将进一步进行相关实验研究,以更好地探索复方黄柏液涂剂所含其他化学成分。

本实验通过测定复方黄柏液涂剂中9种成分的含量,明确了制剂中有效成分并计算出其准确含量,为临床准确、安全、合理用药提供了参考,也有利于进一步提高药品质量控制水平。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[2] 姚俊,赵霞.复方黄柏液最新临床应用进展[J].中国新药杂志,2014,23(3):308-312.

[3] 李友山,杨博华.复方黄柏液外治糖尿病足溃疡对炎性因子及生长因子的影响[J].中国新药杂志,2014,23(10):1163-1166.

[4] 潘军.RP-HPLC法同时测定复方黄柏液中盐酸小檗碱,绿原酸和连翘苷的含量[J].齐鲁药事,2009,28(9):524-526.

[5] 程力惠,卢丽霞.复方黄柏液的质量标准研究[J].亚热带植物科学,2012,41(2):13-18

[6] 范毅,陈玲,朱杰,等.连翘叶化学成分[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(24):22-25.

[7] 邰晓鹏,臧恒昌.HPLC法测定乳痛安口服液中连翘苷的含量[J].药学研究,2015,24(12):703-705.

[8] 邢丽红,李文龙,瞿海斌.金银花提取物中5种有机酸含量测定的紫外光谱法[J].药物分析杂志,2011,31(3):547-551.

[9] 陈芳,邓雁如,郭利平.HPLC法同时测定金银花及金芪降糖片中9种成分的含量[J].天津中医药,2014,31(3):168-172.

[10] 陈天朝,翟来超.HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J].中医研究,2011,24(4):23-25.

[11] 王玉团,许丽丽,林晓,等.RP-HPLC法同时测定羚羊感冒胶囊中5种成分的含量[J].中国药房,2014,25(47):4475-4477.

SimultaneousDeterminationofNineEffectiveComponentsinFufangHuangbaiyeTujibyHPLC-PAD

WANG Yutuan*,XuLili,XuLihua

(ShandongInstituteForFoodAndDrugControl,250101,China)

Objective:To establish a method for simultaneous determination of neochlorogenic acid,chlorogenic acid,4-dicaffeoylquinic acid,phellodendrine chloride,forsythoside A,isochlorogenic acid B,isochlorogenicacidc,berberinehydrochlorideand phillyrin in Fufang Huangbaiye Tuji.Methods:HPLC method was adopted,Agilent extend C18(250 mm ×4.6 mm,5 μm)column was used with acetonitrile-0.5% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1,the column temperature was 25 ℃ and the PAD detection was used.Results:A good linearity of the above compounds was obtained with the correlation coefficients ranged from 12.37~185.55(r=0.999 9),38.80~582.06(r=1.000 0),15.90~238.50(r=0.999 9),1.52~22.86(r=0.999 8),48.26~723.87(r=1.000 0),5.90~88.56(r=0.999 3),6.58~98.64 μg/mL(r=1.000 0),9.79~119.58(r=0.999 9)and 16.91~253.71 μg·mL-1(r=0.999 9),respectively.The average recoveries were 198.63%,102.57%,101.31%,97.95%,102.59%,98.41%,97.59%,98.77% and 101.31%,respectively.The precisions of the method were good,and the RSDs were less than 2.0%(n=5).Conclusion:The method was accurate and reliable,that it could be used for control the quality of Fufang Huangbaiye Tuji.

HPLC-PAD;Fufang Huangbaiye Tuji;content determination

2016-02-18)

*

王玉团,主管药师,研究方向:中药质量控制与研究;Tel:(0531)81216522,E-mail:wytuan@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.026

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