革叶山姜叶挥发油GC-MS分析及活性研究△

开亮，蔡月，付艳辉，宋小平，陈光英，韩长日

(1.海南师范大学 热带药用植物化学教育部重点实验室，海南 海口 571158；2.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158)

革叶山姜叶挥发油GC-MS分析及活性研究△

开亮1，2，蔡月1，付艳辉1，宋小平1，陈光英1，韩长日

(1.海南师范大学 热带药用植物化学教育部重点实验室，海南 海口 571158；2.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158)

目的：分析研究革叶山姜叶挥发油的主要成分及其抗肿瘤活性。方法：采取水蒸气蒸馏法从革叶山姜叶中提取挥发油，利用GC-MS对其化学成分进行分析。采用MTT法检测革叶山姜叶挥发油对细胞Hela、A549的增殖抑制作用。结果：共分离出39个峰，鉴定出31个化学成分，占挥发油总量的94.81%。其主要成分为芳樟醇(34.91%)、橙花叔醇(18.23%)和桉叶油醇(14.48%)。抑制肿瘤细胞增殖的活性结果表明革叶山姜叶挥发油对2种肿瘤细胞株均有一定的抑制活性，其中对人肺腺癌细胞A549的抑制活性相对较好，其IC50值为14.01 μg·mL-1。结论：该实验为革叶山姜的进一步开发研究提供可靠的科学依据。

革叶山姜；挥发油；GC-MS；抗肿瘤活性

山姜属(AlpiniaL.)系姜科植物，总共约有250多种，主要分布在亚热带地区，在我国约有46种，产于东南部至西南部[1]。山姜属植物具有很高的药用价值，其性味辛温，具有保护胃黏膜、镇痛、抗肿瘤、抗氧化、抗应激等药理活性，临床上主要用于脾胃寒证[2]。该属植物红豆蔻、草豆蔻、益智、高良姜均被《中国人民共和国药典》收录[3]。山姜属植物的挥发性成分研究主要集中在高良姜、大高良姜、草豆蔻、红豆蔻、艳山姜等植物，对其他山姜属植物的研究较少[4]。革叶山姜Alpiniacoriacea为姜科山姜属植物，是海南特有植物，截至目前未见任何关于革叶山姜的挥发油成分及其药理活性报道。本课题组前期研究中发现革叶山姜的乙醇提取物具有显著的抗人类免疫缺陷病毒(HIV)活性，为了合理开发利用革叶山姜这一海南特有植物资源，本课题组首次对革叶山姜挥发油成分进行了系统研究。本实验通过水蒸气蒸馏法提取革叶山姜新鲜叶中的挥发油成分，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对革叶山姜叶挥发油进行成分分析，经计算机质谱数据系统检索，面积归一化法确定各成分的质量分数。同时进行抑制肿瘤细胞增殖的活性测试，为革叶山姜药用价值的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与仪器

革叶山姜全草于2014年5月采自海南省昌江霸王岭国家森林公园，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所李蓉涛研究员鉴定为姜科山姜属植物革叶山姜Alpiniacoriacea的全草，凭证标本(No.H20140502)保存于海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室标本室。

Agilent 5975B/6890N型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)，Elx800 型酶标仪(美国宝特公司)，挥发油专用提取装置。实验所用试剂均为市售分析纯试剂，水为蒸馏水。供试肿瘤细胞：人宫颈癌Hela细胞、人肺腺癌A549细胞(中国科学院上海生物研究所)。

2 方法

2.1 挥发油的提取

将新鲜的革叶山姜叶粉碎，取100 g加水浸泡，使用水蒸气蒸馏法[5]提取4 h，再用无水乙醚萃取，得到淡黄色透明油状物。

2.2 分析条件

进样条件：样品瓶温度为100 ℃，定量环(1.0 mL)温度为110 ℃，传输线温度为120 ℃，气相平衡时间为5.5 min，样品平衡时间为7.0 min，样品瓶加压时间为0.1 min，定量环增量时间为0.5 min，样品环平衡时间为0.05 min，进样时间为1.0 min。

GC条件：石英毛细管柱HP-FFAP(30 m×250 μm，0.25 μm)，初始温度为50 ℃，保持 1 min，以5 ℃·min-1速率升温，升温到200 ℃保持5 min，再以8 ℃·min-1升温速率升温到280 ℃保持至完成分析，载气为氦气(99.99%)，柱流量为1.0 mL·min-1，进样口温度为250 ℃，分流比为 50∶1。

MS条件：电离方式为EI电离源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，溶剂延迟为2.5 min，全扫描(Scan)采集模式，质量范围m/z50～550，扫描间隔0.50 s，EM电压1400 V。

2.3 抑制肿瘤细胞增殖活性测试

用含10%胎牛血清的培养液(DMEM)配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，贴壁细胞提前12 h接种培养。加100 μL待测样，设定加6孔，以40 μg·mL-1质量浓度为初筛浓度，根据初筛结果设定5个梯度浓度进行复筛，每种设定3个平行复孔。37 ℃培养48 h后，每孔加四甲偶氮唑盐(MTT)溶液20 μL。继续孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μL的DMSO溶液，使结晶物充分融解。在酶标仪(BioTek ELx800)490 nm读取各孔吸光度值并记录结果，计算挥发油的最大半数抑制浓度(IC50)值[6]。

3 结果

3.1 挥发油成分分析

通过上述实验方法制取革叶山姜挥发油，得到具有特殊香味淡黄色透明油状物1.7 g，提取率为1.7%。按上述的GC-MS条件对革叶山姜叶的挥发油进行分析，GC分离出39个组分，根据面积归一化法从总离子流图(见图1)中计算各组分百分含量，通过质谱数据库Nist08检索，鉴定了31个化学成分，结果见表1。相对质量分数较高的成分为芳樟醇(34.91%)、橙花叔醇(18.23%)和桉叶油醇(14.48%)、合金欢醇(5.62%)等。

图1 革叶山姜叶挥发油总离子流图

表1 革叶山姜叶挥发油成分分析

3.2 挥发油抑制肿瘤细胞增殖活性

采用MTT比色法对挥发油进行抑制肿瘤细胞增殖活性的研究，结果见表2。其对人肺腺癌A549细胞抑制活性相对较好，IC50值为14.01 μg·mL-1，而对人宫颈癌Hela细胞具有中等强度的抑制活性，IC50值为25.69 μg·mL-1。

表2 革叶山姜叶挥发油抑制肿瘤细胞增生活性

4 讨论

对革叶山姜挥发油成分经过GC-MS鉴定分析出了31个化合物，占总含量的94.81%，主要成分为醇类、烯烃类等化合物。革叶山姜叶挥发油中含有多种活性成分，如α-石竹烯可强烈诱导小鼠肝和小肠中的解毒酶谷胱苷肽S-转移酶活性而对化学致癌起抑制作用[7]，陈伟强课题组研究表明α-蒎烯对肝癌BEL-7402细胞的生长有抑制作用[8]。

抑制肿瘤细胞的增殖活性测试结果表明，革叶山姜叶挥发油对人宫颈癌Hela细胞和人肺腺癌A549细胞有抑制活性。这为进一步研究革叶山姜的药用价值提供了理论依据。

[1] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志：第16卷[M].北京：科学出版社，2005：67.

[2] 秦华珍，王晓倩，柳俊辉，等.姜科山姜属中药药理作用的研究进展[J].广西中医药杂志，2010，33(5)：1-3.

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[5] 温悦.挥发油提取方法研究概况[J].中国药业，2010，19(12)：84-85.

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GC-MSAnalysisandBioactivityofEssentialOilfromLeavesofAlpiniacoriacea

KAI Liang1，2，CAIYue1，FUYanhui1，SONGXiaoping1，CHENGuangying1，2，HANChangri1，2*

(1.KeyLaboratoryofTropicalMedicinalPlantChemistryofMinistryofEducation；HainanNormalUniversity，Haikou571158，China；2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering，HainanNormalUniversity，Haikou571158，China)

Objective：To study the chemical constituents and bioactivity of essential oil from the leaves ofAlpiniacoriacea.Methods：The essential oil was extracted by water vapor distillation and analyzed by GC-MS.The inhibitory activity of essential oil on Hela and A549 cell proliferation was assayed using the MTT.Results：GC-MS result showed that there were 39 peaks and 31 compounds were identified，which weighed 94.81% of the essential oil.The major components were linalool(34.91%)，nerolidol(18.23%)and eucalyptol(14.48%).Antitumor activity results showed that has a certain inhibitory activity，including on lung adenocarcinoma A549 cells better inhibitory activity，its IC50value of 14.01 μg·mL-1.Conclusion：The experiment forA.coriaceaprovides reliable scientific basis for further research.

Alpiniacoriacea；essential oil；GC-MS；inhibitory activity

2016-03-21)

国家国际科技合作专项(ISTCP)(2014DFA40850)；国家自然科学基金(81360478，21362009，81160391)

*

韩长日，教授，博士生导师，研究方向：天然药物化学；Tel：(0898)65889422，E-mail：hchr116@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.009